Ključna razlika – primerji za PCR v primerjavi s primerji za sekvenciranje
Z nedavnim razvojem na področju molekularne biologije so bile razvite različne genetske tehnike, ki so olajšale in natančne postopke raziskovanja različnih področij predmeta. Dve pomembni takšni tehniki sta PCR in drugi postopki sekvenciranja. Uporabljajo različne podkomponente. Primerji veljajo za glavne podkomponente, ki so skupne tehnikam PCR in tehnikam sekvenciranja. Primerji PCR se uporabljajo za pomnoževanje določenega zaporedja DNA, medtem ko se začetni primerji za sekvenciranje uporabljajo v kontekstu določanja zaporedja fragmenta DNA z namenom razkritja njegovega posebnega reda nukleotidnega zaporedja. To je ključna razlika med primerji za PCR in primerji za sekvenciranje.
Kaj so primerji PCR?
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je genetska tehnika, ki se uporablja na področju molekularne biologije za pomnoževanje ene ali nekaj kopij določenega segmenta DNK in za pridobitev več milijonov enakih kopij. V reakciji PCR se uporabljajo različne komponente, vključno s primerji. Primerji so kratke verige DNA z dolžino nukleotidov 18-25, zaradi česar so združljivi z začetnim in končnim območjem fragmentov DNA, ki jih je treba pomnožiti. Primerji so lahko prednji in povratni primer. Ti primerji se vežejo na fragment DNA na določenih točkah, kjer poskrbijo, da se DNA polimeraza veže na specifični primer na lokaciji in sproži sintezo nove verige DNA.
Izbira primerjev je pomemben vidik postopka PCR. Pomembna je izbira dolžine temeljnega premaza. Idealna dolžina bi bila 18-25 nukleotidov. Če je dolžina prekratka ali predolga, se primerji ne bodo vezali na zaporedje DNA, da bi se natančno pomnožili. Primerji, ki so prekratki po dolžini, povzročijo nespecifično žarjenje primerjev na različnih lokacijah zaporedja DNK.
Slika 01: Primerji PCR
Vsebnost gvanina in citozina (GC) v dobrem primerju mora biti v območju 40-60. Temperatura žarjenja primerja in temperatura taljenja sta ključna dejavnika med PCR. Temperaturo taljenja je treba natančno izračunati, temperatura žarjenja temeljnega premaza pa mora biti 5 0C nižja od temperature taljenja. Temperatura taljenja naj bo 60 °C in 75 °C. Previsoke ali prenizke temperature bodo povzročile manj aktivno aktivnost DNA polimeraze.
Kaj so primerji za sekvenciranje?
Primeri za sekvenciranje se uporabljajo v kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK z namenom razkriti njegovo specifično identiteto. Za dosego dobrih rezultatov sekvenciranja so pomembni visokokakovostni primerji in predloge. Torej, ko so izbrani primerji, morajo biti edinstveni za določeno regijo, kjer želimo zaporedje. Prav tako mora biti s pravilno usmerjenostjo, kjer so zaporedja običajno ustvarjena od 3' do 5' koncev primerjev. V zaporedju ne bi smelo manjkati nezaželene samohibridizacije, kot je tvorba lasnih zank. Ne sme vsebovati zaporedne tvorbe gvaninskih baz.
Tališče (Tm) temeljnega premaza mora biti primerno za pogoje zaporedja. Zato mora biti med 52oC in 74oC. Pripravo oligonukleotidov, ki bodo uporabljeni kot primer, je treba očistiti, da dobimo želeno celotno dolžino zaporedja. Če oligonukleotidi vsebujejo nečistoče, bo signalizacija sekvence primerja prekrita z različnih začetnih mest in bo tudi zmanjšala število baznih celic.
Slika 02: Primerji za sekvenciranje
Temperatura taljenja primerja (Tm) oligonukleotida določa, kako močno so komplementarne verige DNA hibridizirane med seboj. Tm lahko obravnavamo kot termodinamični izračun, kjer je odvisen od zaporedij DNK in več pogojev, kot je koncentracija soli. Tm je pomemben med PCR, kjer se za izdelavo skupine z dideoksinukleotidom zaključenih fragmentov uporablja različica, imenovana sekvenciranje cikla. Tukaj bo primer, ki je sekvenciran, sprva izmenično žarjen, nato podaljšan in nazadnje denaturiran za pomnoževanje. Zato mora biti vrednost Tm med 52oC in 74o C. Sintetizirane oligonukleotide lahko dobite v laboratorijih za sintezo DNA/RNA v skladu z izbira. Majhen obseg sinteze, ki se uporablja za sekvenciranje DNA, je običajno 50 nmol. Najpomembneje je tudi, da morajo biti primerji, ki se uporabljajo za sekvenciranje, prečiščeni, da ne vsebujejo nečistoč, ki bodo preprečile zmanjšanje kakovosti.
Kakšne so podobnosti med primerji za PCR in primerji za sekvenciranje?
- Tako primerji za PCR kot primerji za sekvenciranje so primerji, ki se uporabljajo v procesu pomnoževanja ciljnega zaporedja DNK.
- Tako primerji PCR kot primerji za sekvenciranje so sestavljeni iz nukleotidov.
- Tako primerji za PCR kot primerji za sekvenciranje so kratki oligomeri.
Kakšna je razlika med primerji za PCR in primerji za sekvenciranje?
PCR primerji v primerjavi s primerji za sekvenciranje |
|
| PCR primerji so kratke verige DNA z dolžino nukleotidnega zaporedja 18-25, zaradi česar so združljivi z začetnim in končnim območjem fragmentov DNA, ki jih je treba pomnožiti. | Primerji za sekvenciranje so kratki oligomeri, ki se uporabljajo v kontekstu sekvenciranja fragmenta DNA z namenom razkriti njegovo specifično identiteto. |
| Funkcija | |
| PCR primerji se uporabljajo za pomnoževanje določenega zaporedja DNK. | Primerji za sekvenciranje se uporabljajo v kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK z namenom razkriti njegovo specifično identiteto. |
| Potrebno število primerjev | |
| Dva primerja; en začetni začetni in en povratni začetni primer se uporabljata kot začetni primer za PCR. | Potrebujete le en primer kot primer za sekvenciranje. |
Povzetek – Primerji za PCR v primerjavi s primerji za sekvenciranje
Primeri za sekvenciranje se uporabljajo v kontekstu sekvenciranja fragmenta DNK z namenom razkriti njegovo specifično identiteto. Za izvedbo postopka bo zadostoval en primer za sekvenciranje. Za doseganje dobrih rezultatov sekvenciranja so pomembni visokokakovostni primerji in predloge. Torej, ko so izbrani primerji, morajo biti edinstveni za določeno regijo, kjer želimo zaporedje. Primerji PCR so kratke verige DNA z dolžino nukleotidov 18-25, ki je združljiva z začetnim in končnim območjem fragmentov DNA, ki jih je treba pomnožiti. Primerji za PCR so lahko začetni začetni in povratni primerji. Vsebnost gvanina in citozina (GC) v dobrem primerju mora biti v območju 40-60. Temperatura žarjenja primerja in temperatura taljenja sta pomembna vidika med PCR. To je razlika med primerji za PCR in primerji za sekvenciranje.
