Ključna razlika med običajnimi ugnezdenimi testi PCR in testi PCR v realnem času je v tem, da je konvencionalni PCR tehnika, razvita za pomnoževanje specifičnih zaporedij DNK, ugnezdeni PCR pa je modifikacija običajnega PCR, ki je sestavljen iz dveh zaporednih reakcij pomnoževanja, medtem ko je pravi -time PCR je različica običajnega PCR, ki lahko kvantificira pomnoženi produkt.
PCR je zelo pogosta znanstvena tehnika, ki se pogosto uporablja v raziskavah in medicini za odkrivanje DNK. PCR testi se uporabljajo za odkrivanje antigenov z odkrivanjem njihove DNK ali RNK. Na splošno je virusna RNA prisotna v telesu, preden zazna protitelesa ali pokaže simptome bolezni. Test PCR lahko zgodaj ugotovi, ali ima nekdo virus ali ne. Trenutno je PCR standardni test za odkrivanje bolezni COVID-19. Obstajajo različne vrste tehnik PCR, kot so PCR v realnem času, ugnezdeni PCR, multipleks PCR, PCR z vročim zagonom in PCR dolgega dosega itd.
Kaj so konvencionalni PCR testi?
Konvencionalni test PCR je in vitro tehnika pomnoževanja DNK, ki se redno izvaja v molekularno bioloških laboratorijih. Ta metoda je omogočila izdelavo na tisoče do milijonov kopij določenega fragmenta DNK. Kary Mullis je to tehniko uvedel leta 1980. Ta tehnika zahteva fragment DNK, znan kot predloga, da bi lahko naredili veliko kopij. Taq polimeraza deluje kot encim DNA polimeraza in katalizira sintezo novih verig vzorčnega zaporedja.
Primerji v mešanici PCR bodo delovali kot izhodišča za podaljške fragmentov. Vse sestavine, ki so potrebne za izdelavo kopij DNK, so vključene v mešanico PCR. Reakcijo PCR izvajamo v napravi za PCR, hraniti pa jo je treba s pravilno mešanico PCR in pravilnim programom PCR. Če sta reakcijska mešanica in program pravilna, bo proizvedel zahtevano število kopij določenega dela DNK iz zelo majhne količine DNK.
Slika 01: Konvencionalni PCR test
Obstajajo trije glavni koraki, ki so vključeni v reakcijo PCR: denaturacija, žarjenje primerja in podaljšanje verige. Ti trije koraki potekajo pri treh različnih temperaturah. Pufer PCR ohranja optimalne pogoje za delovanje polimeraze Taq. Te tri stopnje reakcije PCR se ponavljajo, da se proizvede potrebna količina produkta PCR. Pri vsaki reakciji PCR se število kopij DNK podvoji. Zato lahko pri PCR opazimo eksponentno pomnoževanje. Produkt PCR je mogoče ločiti z gelsko elektroforezo, saj proizvede vidno količino DNA na gelu, in ga je mogoče očistiti za nadaljnje študije, kot je sekvenciranje.
PCR je dragoceno orodje v medicinskih in bioloških raziskavah. Zlasti v forenzičnih študijah ima PCR izjemno vrednost, saj lahko pomnoži DNK za študije iz majhnih vzorcev kriminalcev in naredi forenzične profile DNK. PCR se pogosto uporablja na številnih področjih molekularne biologije, vključno z genotipizacijo, kloniranjem genov, odkrivanjem mutacij, sekvenciranjem DNK, mikromrežami DNK in testiranjem očetovstva.
Kaj so ugnezdeni testi PCR?
Ugnezdeni PCR je vrsta PCR, ki zmanjša nespecifično pomnoževanje DNA. Obstajata dve zaporedni reakciji PCR ali dve zaporedni reakciji pomnoževanja v testu ugnezdene PCR. Med prvo reakcijo pomnoževanja nastane produkt PCR. Po prvi reakciji se izvede druga reakcija pomnoževanja produkta PCR prve reakcije. Zato se primerji v drugi reakcijski zmesi vežejo s prvim produktom PCR in ga pomnožijo.
Slika 02: Ugnezdeni PCR
Pari primerjev so različni v vsaki reakciji. Nespecifična vezava primerjev je zmanjšana pri ugnezdeni PCR. Ugnezdeni testi PCR so uporabni za povečanje občutljivosti in/ali specifičnosti. Vendar ugnezdeni PCR zahteva znanje o zaporedju, ki ga zanima.
Kaj so testi PCR v realnem času?
PCR v realnem času ali kvantitativni PCR (Q PCR) je spremenjena različica PCR, ki kvantitativno meri produkte PCR. Zato ta tehnika kvantificira pomnoževanje v realnem času z uporabo naprave za PCR v realnem času. Je tudi primerna metoda za določanje količine tarčnega zaporedja ali gena, prisotnega v vzorcu.
Zanimiva značilnost PCR v realnem času je, da združuje pomnoževanje in pravo kvantifikacijo v enem koraku. Zato se lahko potreba po gelski elektroforezi za detekcijo odpravi s tehniko PCR v realnem času. Uporaba fluorescenčnih barvil za označevanje produktov PCR med reakcijami PCR bo sčasoma vodila do neposredne kvantifikacije. Ko se produkti PCR kopičijo, se kopičijo tudi fluorescentni signali, ki jih bo izmerila naprava v realnem času. SYBR Green in Taqman sta dve metodi za odkrivanje ali spremljanje procesa pomnoževanja PCR v realnem času. Obe metodi spremljata napredek procesa ojačanja in poročata o količini izdelka v realnem času.
Slika 03: PCR v realnem času
PCR v realnem času ima široko paleto aplikacij, kot so kvantifikacija genske ekspresije, analiza mikroRNA in nekodirajoče RNA, genotipizacija SNP, odkrivanje variant števila kopij, odkrivanje redkih mutacij, odkrivanje gensko spremenjenih organizmov in odkrivanje povzročiteljev okužb.
Kakšne so podobnosti med običajnimi ugnezdenimi in PCR testi v realnem času?
- Ugnezdeni testi PCR in testi PCR v realnem času so modifikacije običajnih testov PCR.
- Vse tri tehnike pomnožijo vzorce DNK.
- Njihove izdelke je mogoče uporabiti pri določanju zaporedja ali analizi.
- Ti testi zahtevajo primerje.
Kakšna je razlika med običajnimi ugnezdenimi in PCR testi v realnem času?
Konvencionalni PCR je tehnika, razvita za pomnoževanje specifičnih zaporedij DNK. Medtem je ugnezdeni PCR modifikacija običajnega PCR, ki je sestavljen iz dveh zaporednih reakcij pomnoževanja, PCR v realnem času pa je različica običajnega PCR, ki lahko kvantificira pomnoženi produkt. To je torej ključna razlika med običajnimi ugnezdenimi in PCR testi v realnem času. Za razliko od običajnega PCR in PCR v realnem času, ugnezdeni PCR uporablja dva niza primerjev. Poleg tega obstajata dve zaporedni reakciji pomnoževanja v ugnezdeni PCR, da se zmanjša nespecifično pomnoževanje. poleg tega običajni testi PCR in PCR v realnem času ne vsebujejo dveh zaporednih reakcij pomnoževanja.
Naslednja infografika navaja razlike med običajnimi ugnezdenimi testi PCR in testi PCR v realnem času v obliki tabele za vzporedno primerjavo.
Povzetek – Običajni proti ugnezdenim ali PCR testi v realnem času
Konvencionalni PCR je prva tehnika, razvita za pomnoževanje specifičnih fragmentov DNK. Ugnezdeni PCR in PCR v realnem času sta dve različici običajnega PCR. V ugnezdeni PCR sta dve zaporedni reakciji pomnoževanja in uporaba dveh kompletov primerjev. PCR v realnem času je razvit za kvantifikacijo pomnoženega produkta PCR. To torej povzema razliko med običajnimi ugnezdenimi in PCR testi v realnem času.
