PCR proti PCR v realnem času
PCR ali verižna reakcija s polimerazo je revolucionarno odkritje v sodobni molekularni biologiji, ki ga je prvi razvil kemik Kary Mullis leta 1983. Omogoča, da se za analizo pomnoži eno samo zaporedje v kompleksni DNK. Osnovna ideja PCR je, da sta dva primerja, ki sta komplementarna nasprotnim verigam zaporedja DNA, usmerjena drug proti drugemu; primerji proizvajajo komplementarne niti, od katerih vsaka vsebuje drugega primerja. Posledično je rezultat velika količina zaporedja, ki ustreza DNK, ki leži med obema primerjema. Za razširitev primerjev v PCR se uporablja encim DNA polimeraza. DNK polimeraza je termostabilen encim in ima sposobnost preživetja pri visokih temperaturah (94 do 95 °C), ki se uporabljajo za denaturacijo vzorčne DNK.
PCR vključuje tri korake, in sicer ponavljajoče se kroge denaturacije, žarjenje primerjev in sintezo DNA. Za izvedbo te reakcije se uporablja termocikličen stroj, tako da ga je mogoče programirati za hitro in natančno spreminjanje temperatur. Aplikacije PCR so kriminalistične preiskave, prstni odtisi DNK, odkrivanje patogenov in analiza DNK zgodnjih človeških vrst.
Kaj je konvencionalni PCR?
Obstajajo tri glavne stopnje konvencionalne PCR, in sicer; Stopnja pomnoževanja DNA, ločevanje PCR in detekcija produktov. Ločevanje segmentov DNK se običajno izvede z elektroforezo v agaroznem gelu. Izdelke nato obarvamo z eteiduim bromidom. Končno se detekcija doseže z vizualizacijo trakov na gelih pod UV svetlobo. Zato končni rezultati konvencionalne PCR niso izraženi s številkami. Običajno lahko konvencionalni PCR zazna samo en parameter.
Kaj je PCR v realnem času?
PCR v realnem času lahko zazna pomnoževanje produktov, ko se produkti sintetizirajo. Z razvojem tehnologije je PCR postal zelo priljubljena tehnika, predvsem za odkrivanje in identifikacijo bakterij v živilih. PCR v realnem času uporablja sistem fluorescentnega barvila in termocikler, opremljen z zmožnostjo zaznavanja fluorescence.
Kakšna je razlika med običajnim PCR in PCR v realnem času?
• Običajni PCR je zamudnejši, saj uporablja gelsko elektroforezo za analizo pomnoženih produktov PCR. V nasprotju s tem je PCR v realnem času manj zamuden, saj lahko zazna pomnožitve v zgodnjih fazah reakcije.
• PCR v realnem času zbira podatke v fazi eksponentne rasti PCR, medtem ko tradicionalni PCR zbira podatke na končni točki reakcije.
• Rezultati končne točke običajnega PCR morda niso zelo natančni, vendar so rezultati PCR v realnem času zelo natančni.
• PCR v realnem času je bolj občutljiv kot običajni PCR.
• Običajni PCR ima zelo slabo ločljivost, medtem ko lahko PCR v realnem času zazna zelo majhne spremembe zaradi visoke ločljivosti.
• Zaznavanje končne točke običajnega PCR ima kratek dinamični razpon, medtem ko ima zaznavanje PCR v realnem času širok dinamični razpon.
• Za razliko od običajnega PCR-ja so tehnike avtomatiziranega odkrivanja na voljo v PCR-ju v realnem času.
• Konvencionalni PCR je zelo izpopolnjen in delovno intenziven bolj kot PCR v realnem času.
• Za razliko od PCR v realnem času, običajni PCR ne more razlikovati med mrtvimi in živimi bakterijami.
• PCR v realnem času uporablja sistem fluorescenčnega barvila za odkrivanje produktov, medtem ko običajni PCR uporablja etidijev bromid in UV svetlobo za vizualizacijo trakov v mediju agaroznega gela.
