Ključna razlika – NGS proti Sangerjevemu zaporedju
Next Generation Sequencing (NGS) in Sanger Sequencing sta dve vrsti tehnik zaporedja nukleotidov, ki sta se razvili skozi čas. Metoda Sangerjevega zaporedja se je dolgo uporabljala na široko, NGS pa jo je pred kratkim nadomestil zaradi njenih prednosti. Ključna razlika med NGS in Sanger Sequencing je v tem, da NGS deluje na principu sekvenciranja milijonov sekvenc hkrati na hiter način skozi sistem sekvenciranja, medtem ko Sanger Sequencing deluje na principu prekinitve verige zaradi selektivne vključitve dideoksinukleotidov z encimom DNA polimeraza med replikacijo DNK in posledično ločitvijo fragmentov s kapilarno elektroforezo.
Kaj je sekvenciranje nukleotidov?
Genetske informacije so shranjene v nukleotidnih zaporedjih DNK ali RNK organizma. Postopek določanja pravilnega vrstnega reda nukleotidov (z uporabo štirih baz) v danem fragmentu (v genu, skupini genov, kromosomu in celotnem genomu) je znan kot sekvenciranje nukleotidov. V genomskih študijah, forenzičnih študijah, virologiji, biološki sistematiki, medicinski diagnostiki, biotehnologiji in na številnih drugih področjih je zelo pomembno analizirati strukturo in delovanje genov. Obstajajo različne vrste metod zaporedja, ki so jih razvili znanstveniki. Med njimi je Sangerjevo zaporedje, ki ga je razvil Frederick Sanger leta 1977, široko uporabljano in popularizirano dolgo časa, dokler ga ni nadomestilo zaporedje naslednje generacije.
Kaj je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je izraz, ki se uporablja za označevanje sodobnih visoko zmogljivih procesov zaporedja. Opisuje številne različne sodobne tehnologije sekvenciranja, ki so revolucionirale genomske študije in molekularno biologijo. Te tehnike so sekvenciranje Illumina, sekvenciranje Roche 454, sekvenciranje ionskih protonov in sekvenciranje SOLiD (sekvenciranje z zaznavanjem oligo ligacije). Sistemi NGS so hitrejši in cenejši. V sistemih NGS se uporabljajo štiri glavne metode sekvenciranja DNK, in sicer; pirosekvenciranje, sekvenciranje s sintezo, sekvenciranje z ligacijo in sekvenciranje ionskih polprevodnikov. Veliko število verig DNK ali RNK (na milijone) je mogoče sekvencirati vzporedno. Omogoča sekvenciranje celotnega genoma organizmov v kratkem časovnem obdobju, za razliko od Sangerjevega sekvenciranja, ki vzame več časa.
NGS ima številne prednosti pred običajno Sangerjevo metodo sekvenciranja. To je hiter, natančnejši in stroškovno učinkovit postopek, ki ga je mogoče izvesti z majhno velikostjo vzorca. NGS se lahko uporablja v metagenomskih študijah, pri odkrivanju variacij znotraj posameznega genoma zaradi vstavljanj in izbrisov itd. ter pri analizi izražanja genov.
Slika_1: Razvoj v zaporedju NGS
Kaj je Sangerjevo zaporedje?
Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki so jo leta 1977 razvili Frederick Sanger in njegovi sodelavci za določitev natančnega vrstnega reda nukleotidov danega fragmenta DNA. Znano je tudi kot sekvenciranje prekinitve verige ali dideoksi sekvenciranje. Načelo delovanja te metode je prekinitev sinteze verige s selektivno vključitvijo dideoksinukleotidov (ddNTP), ki končujejo verigo, kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP, s polimerazo DNA med replikacijo DNA. Normalni nukleotidi imajo 3' OH skupine za tvorbo fosfodiesterske vezi med sosednjimi nukleotidi za nadaljevanje tvorbe verige. Vendar pa ddNTP nimajo te 3' OH skupine in ne morejo tvoriti fosfodiestrskih vezi med nukleotidi. Zato je raztezanje verige prekinjeno.
Pri tej metodi enoverižna DNK, ki jo je treba sekvencirati, služi kot vzorčna veriga za in vitro sintezo DNK. Druge zahteve so oligonukleotidni primer, deoksinukleotidni prekurzorji in encim DNA polimeraza. Ko so znani bočni konci ciljnega fragmenta, je mogoče zlahka oblikovati primerje za replikacijo DNK. Štiri ločene reakcije sinteze DNK se izvajajo v štirih ločenih epruvetah. Vsaka epruveta ima ločene ddNTP skupaj z drugimi zahtevami. Iz določenega nukleotida se doda mešanica dNTP in ddNTP. Prav tako potekajo štiri ločene reakcije v štirih epruvetah s štirimi mešanicami. Po reakcijah se izvede detekcija fragmentov DNA in pretvorba vzorca fragmenta v informacijo o zaporedju. Nastali fragmenti DNK so toplotno denaturirani in ločeni z gelsko elektroforezo. Če uporabimo radioaktivne nukleotide, lahko vzorec trakov v poliakrilamidnem gelu vizualiziramo z avtoradiografijo. Kadar ta metoda uporablja fluorescenčno označene dideoksinukleotide, jih je mogoče ublažiti po branju gela in prenesti skozi laserski žarek, ki ga zazna fluorescentni detektor. Da bi se izognili napakam, ki bi se lahko pojavile, ko zaporedje berete z očesom in ročno vnesete v računalnik, se je ta metoda razvila v uporabo avtomatskega sekvencerja, povezanega z računalnikom.
To je metoda, ki se uporablja za sekvenciranje DNK iz projekta Človeški genom. Ta metoda je še vedno v uporabi z naprednimi modifikacijami, ker daje natančne informacije o zaporedju, čeprav je drag in počasen postopek.
Slika_2: Sangerjevo zaporedje
Kakšna je razlika med NGS in Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) se nanaša na sodobne postopke sekvenciranja z visoko zmogljivostjo. Opisuje številne različne sodobne tehnologije zaporedja | Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki jo je razvil Frederick Sanger za določanje natančnega vrstnega reda nukleotidov danega fragmenta DNK. |
| Stroškovna učinkovitost | |
| NGS je cenejši postopek, ker zmanjša čas, človeško moč in kemikalije. | To je drag postopek, ker zahteva čas, človeško moč in več kemikalij. |
| Hitrost | |
| To je hitreje, saj kemično zaznavanje in zaznavanje signala številnih pramenov potekata vzporedno. | To je zamudno, saj se kemično zaznavanje in zaznavanje signala zgodita kot dva ločena procesa in lahko naenkrat bere samo na verigi. |
| Zanesljivost | |
| NGS je zanesljiv. | Sangerjevo sekvenciranje je manj zanesljivo |
| Velikost vzorca | |
| NGS zahteva manjšo količino DNK. | Ta metoda potrebuje veliko količino vzorčne DNK. |
| Baze DNK na sekvencirani fragment | |
| Število baz DNK na sekvencirani fragment je nižje kot pri Sangerjevi metodi | Ustvarjalna zaporedja so daljša od zaporedij NGS. |
Povzetek – NGS proti Sangerjevemu zaporedju
NGS in Sangerjevo zaporedje sta tehniki zaporedja nukleotidov, ki se v veliki meri uporabljata v molekularni biologiji. Sangerjevo sekvenciranje je zgodnja metoda sekvenciranja, ki jo je nadomestil NGS. Glavna razlika med NGS in Sangerjevim sekvenciranjem je, da je NGS hitrejši, natančnejši in stroškovno učinkovit postopek kot Sangerjevo sekvenciranje. Obe tehniki sta povzročili velike izbruhe v genetiki in biotehnologiji.
