Ključna razlika – cDNA proti genomski knjižnici
Obstajata dve glavni vrsti knjižnic DNK, ki so jih znanstveniki zgradili s tehnikami genskega inženiringa. To sta knjižnica cDNA in genomska knjižnica. Ključna razlika med cDNA in genomsko knjižnico je v tem, da knjižnica cDNA vsebuje klonirano komplementarno DNA celotne mRNA organizma, medtem ko knjižnica genomske DNA vsebuje klonirane fragmente celotnega genoma organizma. Knjižnica genomske DNK je večja od knjižnice cDNK.
Kaj je genomska knjižnica?
Knjižnica genomske DNK je zbirka klonov, ki nosijo fragmente celotne genomske DNK organizma. Vsebuje celotno genomsko DNK tega organizma, vključno s kodirajočimi in nekodirajočimi sekvencami. Izdelava genomske knjižnice poteka s tehnologijo rekombinantne DNA, ki ji sledi kloniranje (genski inženiring). Konstrukcija vključuje različne korake, kot je prikazano na sliki 01. Postopek se začne z izolacijo genomske DNK. Z uporabo ustreznega protokola za ekstrakcijo DNK je treba izolirati celotno genomsko DNK organizma. Nato je treba DNK pretvoriti v obvladljive velikosti ali v specifične fragmente z restrikcijskimi endonukleazami (encimi za rezanje DNK). Fragmentirano DNK je treba vstaviti v vektorje z uporabo DNK ligaz (encimov za spajanje DNK). Vektor je organizem, ki se sam razmnožuje. Plazmidi in bakteriofagi so običajno uporabljeni vektorji v tehnologiji rekombinantne DNA. Ti vezani vektorji so znani kot rekombinantne molekule DNA, saj nosijo lastne in vstavljene sekvence DNA. Rekombinantni vektorji so dodani gostiteljski bakteriji in pripravljeni za prevzem rekombinantnih vektorjev znotraj bakterijske celice. Bakterije z rekombinantnimi vektorji (plazmidi) je treba gojiti v gojišču. Med razmnoževanjem bakterij bakterijska DNK skupaj z rekombinantnimi plazmidi replicira njihove genome in proizvaja klone. Ti kloni vsebujejo celoten genom izvornega organizma. Zato se imenuje genomska knjižnica. Plazmide je mogoče zlahka ločiti od bakterijske kromosomske DNK, da sestavi genomska knjižnica tega organizma. Če določen organizem vsebuje zanimive gene, ga je enostavno odkriti v genomski knjižnici s hibridizacijo z uporabo molekularnih sond (markerjev).
Genomske knjižnice so pomembne za preučevanje genomske strukture in delovanja, specifičnih genov, lokacije genov, preslikave genov, mutacij, sekvenciranja genov, identifikacije novih terapevtskih genov itd.
Slika_1: Konstrukcija genomske knjižnice
Kaj je knjižnica cDNA?
Knjižnica cDNA je zbirka komplementarnih klonov DNA (cDNA), sintetiziranih iz celotne mRNA organizma. Postopek gradnje vključuje različne korake. Čiščenje celotne mRNA iz organizma je prvi vključeni korak. Izolirana mRNA se pretvori v verige cDNA s postopkom, imenovanim reverzna transkripcija. Reverzno transkripcijo olajša encim, imenovan reverzna transkriptaza. Uporablja majhen 3' primer in sproži sintezo prve cDNA verige, ki je komplementarna matrični verigi mRNA. Nastala dvoverižna cDNA se pretvori v manjše fragmente z uporabo restrikcijskih endonukleaz in vstavi v ustrezne vektorje. Te konstruirane rekombinantne molekule se nato dodajo v gostiteljski organizem in gojijo v gojišču za proizvodnjo klonov. Zbirka klonov, ki vsebuje fragmente cDNA organizma, je znana kot knjižnica cDNA. Popolnoma razrezana zrela mRNA ne vsebuje intronov in regulatornih regij. Zato nekodirajoči fragmenti niso prisotni v knjižnicah cDNA za razliko od genomske knjižnice.
Knjižnice cDNA so pomembne za analizo kodirnih regij, genskih funkcij, izražanja genov itd.
Slika_2: Izdelava knjižnice cDNA
Kakšna je razlika med cDNA in genomsko knjižnico?
cDNA proti genomski knjižnici |
|
| knjižnica cDNA je zbirka klonov, ki nosijo komplementarno DNA mRNA organizma | Genomska knjižnica je zbirka klonov, ki nosijo celotno genomsko DNK organizma. |
| Kodiranje proti nekodirajočim zaporedjem | |
| knjižnica cDNA vsebuje samo kodirne sekvence; ne vsebuje intronov. | Genomsko knjižnico sestavlja celotna genomska DNK, vključno z nekodirajočo (introni in regulatorno) DNK. |
| Velikost | |
| knjižnica cDNA je majhna. | Genomska knjižnica je velika. |
| Izhodiščni material | |
| Izhodni material je mRNA | Izhodiščni material je DNK. |
| Vpletenost povratne transkripcije. | |
| Reverzna transkripcija se zgodi pri prvi sintezi verige cDNA. | Povratni prepis se ne zgodi. |
Povzetek – cDNA in genomska knjižnica
Genomska knjižnica predstavlja populacijo klonov, ki nosijo fragmentirano celotno genomsko DNK organizma. Knjižnica cDNA predstavlja populacijo klonov, ki nosijo komplementarno DNA celotne mRNA organizma. Klon cDNA vsebuje samo zaporedja, ki jih najdemo v mRNA, medtem ko genomski klon vsebuje zaporedja celotnega genoma. To je razlika med cDNA in genomsko knjižnico.
