Ključna razlika – mikromreža v primerjavi s sekvenciranjem RNA
Transkriptom predstavlja celotno vsebino RNA, ki je prisotna v celici, vključno z mRNA, rRNA, tRNA, razgrajeno RNA in nerazgrajeno RNA. Profiliranje transkriptoma je pomemben proces za razumevanje celičnih vpogledov. Obstaja več naprednih metod za profiliranje transkriptoma. Mikromrež in sekvenciranje RNA sta dve vrsti tehnologij, razvitih za analizo transkriptoma. Ključna razlika med sekvenciranjem mikromrež in RNA je v tem, da mikromreže temeljijo na hibridizacijskem potencialu vnaprej oblikovanih označenih sond s ciljnimi zaporedji cDNA, medtem ko sekvenciranje RNA temelji na neposrednem sekvenciranju verig cDNA z naprednimi tehnikami sekvenciranja, kot je NGS. Mikromreže se izvajajo s predhodnim znanjem o zaporedjih, sekvenciranje RNA pa brez predhodnega znanja o zaporedjih.
Kaj je Microarray?
Microarray je robustna, zanesljiva in visoko zmogljiva metoda, ki jo znanstveniki uporabljajo za profiliranje transkriptoma. Je najbolj priljubljen pristop za analizo prepisov. Je poceni metoda, ki je odvisna od hibridizacijskih sond.
Tehnika se začne z ekstrakcijo mRNA iz vzorca in konstrukcijo knjižnice cDNA iz celotne RNA. Nato se zmeša s fluorescenčno označenimi vnaprej oblikovanimi sondami na trdni površini (točkovna matrika). Komplementarne sekvence se hibridizirajo z označenimi sondami v mikromreži. Nato se mikromreža spere in preseje, slika pa se kvantificira. Zbrane podatke je treba analizirati, da dobimo relativne profile izražanja.
Predpostavlja se, da je intenzivnost sond mikromrež sorazmerna s količino transkriptov v vzorcu. Vendar pa je natančnost tehnike odvisna od oblikovanih sond, predhodnega poznavanja zaporedja in afinitete sond za hibridizacijo. Zato ima tehnologija mikromrež omejitve. Tehnike mikromrež ni mogoče izvesti s prepisi z nizko številčnostjo. Ne razlikuje izoform in ne identificira genetskih variant. Ker je ta metoda odvisna od hibridizacije sond, se pri tehniki mikromrež pojavljajo nekatere težave, povezane s hibridizacijo, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija itd.
Slika 01: Mikroniz
Kaj je sekvenciranje RNA?
RNK puško sekvenciranje (RNA seq) je nedavno razvita tehnika sekvenciranja celotnega transkriptoma. To je hitra in visoko zmogljiva metoda profiliranja transkriptoma. Neposredno kvantificira izražanje genov in povzroči globoko preiskavo transkriptoma. RNA seq ni odvisen od vnaprej oblikovanih sond ali predhodnega poznavanja zaporedij. Zato ima metoda RNA seq visoko občutljivost in sposobnost odkrivanja novih genov in genetskih variant.
Metoda sekvenciranja RNA poteka v več korakih. Celotno RNA celice je treba izolirati in razdrobiti. Nato je treba z uporabo reverzne transkriptaze pripraviti knjižnico cDNA. Vsako verigo cDNA je treba povezati z adapterji. Nato je treba povezane fragmente pomnožiti in očistiti. Na koncu z uporabo metode NGS je treba izvesti sekvenciranje cDNA.
Slika 02: Sekvenciranje RNA
Kakšna je razlika med Microarray in RNA sekvenciranjem?
Mikromreža proti zaporedju RNK |
|
| Microarray je robustna, zanesljiva metoda z visoko zmogljivostjo. | Sekvenciranje RNK je natančna in visoko zmogljiva metoda. |
| Cost | |
| To je poceni metoda. | To je draga metoda. |
| Analiza velikega števila vzorcev | |
| To olajša analizo velikega števila vzorcev hkrati. | To olajša analizo velikega števila vzorcev. |
| Analiza podatkov | |
| Analiza podatkov je kompleksna. | S to metodo se ustvari več podatkov; zato je postopek bolj zapleten. |
| Predznanje o zaporedjih | |
| Ta metoda temelji na hibridizacijskih sondah, zato je potrebno predhodno znanje o zaporedjih. | Ta metoda ni odvisna od predhodnega poznavanja zaporedja. |
| Strukturne variacije in novi geni | |
| Ta metoda ne more zaznati strukturnih variacij in novih genov. | Ta metoda lahko zazna strukturne variacije, kot so spajanje genov, alternativno spajanje in novi geni. |
| Občutljivost | |
| To ne more zaznati razlik v izražanju izooblik, zato ima omejeno občutljivost. | To ima visoko občutljivost. |
| Izid | |
| To lahko povzroči le relativne ravni izražanja. To ne daje absolutne kvantifikacije izražanja genov. | Podaja absolutne in relativne ravni izražanja. |
| Ponovna analiza podatkov | |
| To je treba znova zagnati za ponovno analizo. | Podatke o zaporedju je mogoče ponovno analizirati. |
| Potreba po posebnem osebju in infrastrukturi | |
| Za mikromreže ni potrebna posebna infrastruktura in osebje. | Specifična infrastruktura in osebje, ki sta potrebna za sekvenciranje RNA. |
| Tehnične težave | |
| Tehnika mikromrež ima tehnične težave, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, omejena stopnja zaznavanja posameznih sond itd. | Tehnika RNA seq se izogne tehničnim težavam, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, omejena stopnja zaznavanja posameznih sond itd. |
| Pristranskosti | |
| To je pristranska metoda, saj je odvisna od hibridizacije. | Pristranskost je majhna v primerjavi z mikromrežami. |
Povzetek – Mikromreža proti zaporedju RNA
Metode sekvenciranja mikromrež in RNA so visoko zmogljive platforme, razvite za profiliranje transkriptoma. Obe metodi dajeta rezultate, ki so zelo povezani s profili izražanja genov. Vendar ima sekvenciranje RNA prednosti pred mikromrežami za analizo izražanja genov. Sekvenciranje RNA je bolj občutljiva metoda za odkrivanje transkriptov z nizko abundanco kot mikromreža. Sekvenciranje RNA omogoča tudi razlikovanje med izoformami in identifikacijo genskih različic. Vendar je mikromreža pogosta izbira večine raziskovalcev, saj je sekvenciranje RNA nova in draga tehnika z izzivi pri shranjevanju podatkov in zapleteno analizo podatkov.
