Ključna razlika med puško sekvenciranjem in sekvenciranjem naslednje generacije je v tem, da je puško sekvenciranje metoda zaporedja, ki naključno razbije zaporedja DNK na veliko majhnih fragmentov in ponovno sestavi zaporedje z opazovanjem prekrivajočih se regij, medtem ko zaporedje naslednje generacije (NGS) je napredna metoda genetskega sekvenciranja, ki temelji na kapilarni elektroforezi.
Sekvenciranje je postopek, ki določa natančen vrstni red nukleotidov v genu, skupini genov, kromosomu in celotnem genomu. Analiza strukture in delovanja genov ter identifikacija organizmov je zelo pomembna v genomskih študijah, forenzičnih študijah, virologiji, biološki sistematiki, medicinski diagnostiki, biotehnologiji in na številnih drugih področjih. Poleg tega so na voljo različne vrste metod zaporedja. Med njimi sta dve napredni metodi Shotgun Sequencing in Next Generation Sequencing.
Kaj je sekvenciranje puške?
Shotgun sekvenciranje je metoda sekvenciranja, ki naključno razbije zaporedja DNK celotnega kromosoma ali celotnega genoma na številne majhne fragmente in znova sestavi zaporedja z računalniki z opazovanjem prekrivajočih se zaporedij ali regij. Na splošno so genomi sesalcev strukturno zapleteni in večji. Zato jih je težko zaporediti s kloniranjem, saj je zamudno. Sekvenciranje puške je hitrejša metoda. Je tudi cenejša za izvedbo. Zato se sodobni znanstveniki pri reševanju kompleksnih genomov zanašajo na metodo sekvenciranja puške.
Slika 01: Zaporedje šibrenice
Postopek sekvenciranja puške je sorazmerno preprost. Začne se s fragmentacijo celotnega genoma v različne velikosti od 20-kilogramskih baz do 300-kilogramskih baz. Nato je treba vsak fragment sekvencirati z metodo prekinitve verige. Po zaporedju je treba z uporabo sofisticirane računalniške programske opreme sestaviti fragmente tako, da si ogledate prekrivajoče se regije. Običajno preslikava in kloniranje zaporedij za to metodo nista potrebna. Poleg tega pri tej metodi ni uporabe genetske karte. Ker pa ni uporabe obstoječih zemljevidov genoma, je večja verjetnost, da se bodo med sestavljanjem pojavile napake. To je ena glavnih pomanjkljivosti te metode. Poleg tega krajši fragmenti zagotavljajo manj edinstvenih informacij za vsako branje v tej metodi. Poleg tega sekvenciranje puške ne ustvari dovolj podatkov za določitev konsenznega zaporedja z zahtevanim standardom natančnosti.
Kljub zgoraj omenjenim pomanjkljivostim je metoda sekvenciranja s puško trenutno najučinkovitejša in stroškovno učinkovita strategija za sekvenciranje mikrobnih genomov, vključno z bakterijami, virusi in kvasovkami. To je zato, ker njihovi genomi nimajo ponavljajočih se regij, ki jih je težko zaporediti, in je mogoče te genome zlahka sestaviti v kromosome brez napak.
Kaj je zaporedje naslednje generacije?
Next Generation Sequencing (NGS) je izraz, ki se uporablja za označevanje sodobnih visoko zmogljivih procesov zaporedja. Opisuje številne različne sodobne tehnologije sekvenciranja, ki so revolucionirale genomske študije in molekularno biologijo. Te tehnike vključujejo sekvenciranje Illumina, sekvenciranje Roche 454, sekvenciranje ionskih protonov in sekvenciranje SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Sistemi NGS so hitrejši in cenejši. V sistemih NGS se uporabljajo štiri glavne metode sekvenciranja DNK: pirosekvenciranje, sekvenciranje s sintezo, sekvenciranje z ligacijo in sekvenciranje ionskih polprevodnikov. Z NGS je mogoče vzporedno sekvencirati veliko število verig DNA ali RNA (na milijone). Omogoča sekvenciranje celotnega genoma organizmov v kratkem času.
Slika 02: Zaporedje naslednje generacije
NGS ima različne prednosti. To je hiter, natančnejši in stroškovno učinkovit postopek, ki ga je mogoče izvesti z majhno velikostjo vzorca. Zato omogoča analizo celotnega človeškega genoma v enem samem poskusu sekvenciranja. Poleg tega se lahko NGS uporablja v metagenomskih študijah, pri odkrivanju variacij znotraj posameznega genoma zaradi vstavljanj in izbrisov itd., ter pri analizi izražanja genov. Poleg tega lahko NGS analizira celotne transkriptome iz velikega števila tkiv hkrati. Zato je NGS revolucioniral analizo transkriptomov.
Kakšne so podobnosti med sekvenciranjem puške in sekvenciranjem naslednje generacije?
- Shotgun sekvenciranje in sekvenciranje naslednje generacije sta dve metodi sekvenciranja genoma.
- Obe metodi sta hitri metodi.
- Poleg tega so stroškovno učinkovite metode.
- Sposobni so zaporedja številnih fragmentov DNK vzporedno.
Kakšna je razlika med sekvenciranjem puške in sekvenciranjem naslednje generacije?
Shotgun sekvenciranje in sekvenciranje naslednje generacije sta dve napredni tehniki sekvenciranja. Metoda sekvenciranja s puško naključno razbije zaporedja DNK celotnega kromosoma ali celotnega genoma na veliko majhnih fragmentov in znova sestavi zaporedja z računalniki z opazovanjem prekrivajočih se zaporedij ali regij. V nasprotju s tem je zaporedje naslednje generacije (NGS) izraz, ki se nanaša na sodobne procese zaporedja z visoko zmogljivostjo. Torej, to je ključna razlika med sekvenciranjem puške in sekvenciranjem naslednje generacije. Poleg tega je sekvenciranje naslednje generacije tehnika, ki je odvisna od kapilarne elektroforeze, medtem ko sekvenciranje puške ni odvisno. Zato je to tudi razlika med sekvenciranjem puške in sekvenciranjem naslednje generacije. Poleg tega je v primerjavi s sekvenciranjem puške sekvenciranje naslednje generacije zelo občutljivo in zelo natančno.
Povzetek – Sekvenciranje puške v primerjavi s sekvenciranjem naslednje generacije
Shotgun sekvenciranje in sekvenciranje naslednje generacije sta dve metodi sekvenciranja, ki se uporabljata pri sekvenciranju genoma. Obe metodi sta hitri in stroškovno učinkoviti metodi. NGS deluje na principu sekvenciranja milijonov sekvenc hkrati na hiter način prek sistema sekvenciranja. Nasprotno pa sekvenciranje iz puške zahteva razbijanje genomov na majhne fragmente ter sekvenciranje in ponovno sestavljanje z uporabo prekrivajočih se sekvenc. Torej, to povzema razliko med sekvenciranjem puške in sekvenciranjem naslednje generacije.
