Ključna razlika – Sangerjevo sekvenciranje proti pirosekvenciranju
Določanje zaporedja DNK je zelo pomembno za analizo DNK, saj poznavanje pravilne razporeditve nukleotidov na določeni regiji DNK razkrije veliko pomembnih informacij o njej. Obstajajo različne metode sekvenciranja DNK. Sangerjevo sekvenciranje in pirosekvenciranje sta dve različni metodi sekvenciranja DNK, ki se pogosto uporabljata v molekularni biologiji. Ključna razlika med Sangerjevim sekvenciranjem in pirosekvenciranjem je v tem, da Sangerjevo sekvenciranje uporablja dideoksinukleotide za prekinitev sinteze DNK za branje nukleotidnega zaporedja, medtem ko pirosekvenciranje zazna sproščanje pirofosfata z vključitvijo nukleotidov in sintetiziranjem komplementarnega zaporedja za branje natančnega vrstnega reda zaporedja.
Kaj je Sangerjevo zaporedje?
Sangerjevo sekvenciranje je prva generacija metode sekvenciranja DNK, ki so jo leta 1977 razvili Frederick Sanger in njegovi kolegi. Znana je tudi kot sekvenciranje prekinitve verige ali dideoksi sekvenciranje, saj temelji na prekinitvi verige z dideoksinukleotidi (ddNTP). Ta metoda se je široko uporabljala več kot 30 let, dokler ni bila razvita nova generacija sekvenciranja (NGS). Sangerjeva tehnika sekvenciranja je omogočila odkritje pravilnega vrstnega reda nukleotidov ali pritrditev določenega fragmenta DNA. Temelji na selektivni vključitvi ddNTP in prekinitvi sinteze DNA med replikacijo DNA in vitro. Odsotnost 3' OH skupin za nadaljevanje tvorbe fosfodiestrske vezi med sosednjimi nukleotidi je edinstvena značilnost ddNTP. Torej, ko je ddNTP pritrjen, se raztezanje verige preneha in konča od te točke. V Sangerjevem sekvenciranju se uporabljajo štirje ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP in ddTTP. Ti nukleotidi ustavijo proces replikacije DNK, ko se vključijo v rastočo verigo DNK in povzročijo različne dolžine kratke DNK. Kapilarna gelska elektroforeza se uporablja za organizacijo teh kratkih verig DNA glede na njihovo velikost na gelu, kot je prikazano na sliki 01.
Slika 1: Kapilarna gelska elektroforeza sintetizirane kratke DNA
Za podvajanje DNK in vitro je treba zagotoviti nekaj zahtev. So encim DNA polimeraza, šablona DNA, oligonukleotidni primerji in deoksinukleotidi (dNTP). Pri Sangerjevem sekvenciranju se replikacija DNK izvaja v štirih ločenih epruvetah skupaj s štirimi vrstami ddNTP ločeno. Deoksinukleotidi niso v celoti nadomeščeni z ustreznimi ddNTP. Mešanica določenega dNTP (na primer; dATP + ddATP) je vključena v epruveto in replicirana. Štirje ločeni produkti v epruveti se izvajajo na gelu v štirih ločenih vdolbinicah. Nato lahko z branjem gela sestavimo zaporedje, kot je prikazano na sliki 02.
Slika 02: Sangerjevo zaporedje
Sangerjevo sekvenciranje je pomembna tehnika, ki pomaga na številnih področjih molekularne biologije. Projekt človeškega genoma je bil uspešno zaključen s pomočjo Sangerjevih metod, ki temeljijo na sekvenciranju. Sangerjevo sekvenciranje je uporabno tudi pri sekvenciranju tarčne DNA, raziskavah raka in genetskih bolezni, analizi izražanja genov, identifikaciji ljudi, odkrivanju patogenov, mikrobnem sekvenciranju itd.
Sangerjevo zaporedje ima več pomanjkljivosti:
- Dolžina sekvencirane DNK ne sme biti daljša od 1000 baznih parov
- Naenkrat je mogoče zaporediti samo en niz.
- Postopek je dolgotrajen in drag.
Zato so bile sčasoma razvite nove napredne tehnike zaporedja za premagovanje teh težav. Vendar je Sangerjevo sekvenciranje še vedno v uporabi zaradi zelo natančnih rezultatov do približno 850 fragmentov dolžine baznih parov.
Kaj je pirosekvenciranje?
Pirosekvenciranje je nova tehnika sekvenciranja DNK, ki temelji na "sekvenciranju s sintezo". Ta tehnika temelji na odkrivanju sproščanja pirofosfata ob vključitvi nukleotida. Proces uporabljajo štirje različni encimi: DNA polimera, ATP sulfurilaza, luciferaza in apiraza ter dva substrata adenozin 5' fosfosulfat (APS) in luciferin.
Proces se začne z vezavo primerja na enoverižno DNA šablono in DNA polimeraza začne vgrajevanje nukleotidov, ki so mu komplementarni. Ko se nukleotidi združijo (polimerizacija nukleinske kisline), sprostijo pirofosfatne (dve skupaj povezani fosfatni skupini) skupine in energijo. Vsak dodatek nukleotida sprosti ekvimolarno količino pirofosfata. Pirofosfat se pretvori v ATP s pomočjo ATP sulfurilaze v prisotnosti substrata APS. Ustvarjeni ATP poganja z luciferazo posredovano pretvorbo luciferina v oksiluciferin, ki proizvaja vidno svetlobo v količinah, ki so sorazmerne s količino ATP. Svetlobo zazna naprava za zaznavanje fotonov ali fotopomnoževalec in ustvari pirogram. Apiraza razgradi ATP in nevgrajene dNTP v reakcijski mešanici. Dodajanje dNTP se izvede enkrat naenkrat. Ker je dodajanje nukleotida znano glede na vključitev in detekcijo svetlobe, je mogoče določiti zaporedje predloge. Pirogram se uporablja za generiranje nukleotidnega zaporedja vzorca DNA, kot je prikazano na sliki 03.
Pirosekvenciranje je zelo pomembno pri analizi polimorfizma enega nukleotida in sekvenciranju kratkih odsekov DNK. Visoka natančnost, prilagodljivost, enostavnost avtomatizacije in vzporedna obdelava so prednosti pirosekvenciranja pred tehnikami Sangerjevega sekvenciranja.
Slika 03: Pirosekvenciranje
Kakšna je razlika med Sangerjevim sekvenciranjem in pirosekvenciranjem?
Sangerjevo sekvenciranje proti pirosekvenciranju |
|
| Sangerjevo sekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA, ki temelji na selektivni vključitvi ddNTP s polimerazo DNA in terminaciji verige. | Pirosekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA, ki temelji na detekciji sproščanja pirofosfata ob vključitvi nukleotida. |
| Uporaba ddNTP | |
| ddNTP se uporabljajo za prekinitev replikacije DNA | ddNTP se ne uporabljajo. |
| Vključeni encimi | |
| Uporablja se DNA polimeraza. | Uporabljeni so štirje encimi: DNA polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza in apiraza. |
| Uporabljeni substrati | |
| APS in Luciferin se ne uporabljata. | Uporabljata se adenozin 5' fosfosulfat (APS) in luciferin. |
| Najvišja temperatura | |
| To je počasen proces. | To je hiter postopek. |
Povzetek – Sangerjevo sekvenciranje proti pirosekvenciranju
Sangerjevo sekvenciranje in pirosekvenciranje sta dve metodi sekvenciranja DNK, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Sangerjevo sekvenciranje konstruira vrstni red nukleotidov v zaporedju s prekinitvijo raztezanja verige, medtem ko pirosekvenciranje konstruira natančen vrstni red nukleotidov v zaporedju z vključitvijo nukleotidov in zaznavanjem sproščanja pirofosfatov. Zato je glavna razlika med Sangerjevim sekvenciranjem in pirosekvenciranjem ta, da Sangerjevo sekvenciranje deluje na sekvenciranje s prekinitvijo verige, medtem ko pirosekvenciranje deluje na sekvenciranje s sintezo.
