Ključna razlika – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidi so osnovne strukturne enote in gradniki DNK. Molekula DNK je sestavljena iz polinukleotidne verige. V DNK najdemo štiri različne nukleotide. Ti nukleotidi so sestavljeni iz štirih različnih dušikovih baz, imenovanih A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Vrstni red nukleotidov v molekuli DNK je zelo pomemben, saj je v njem zapisana pomembna genetska informacija za rast in razvoj organizmov. Sekvenciranje DNK se nanaša na postopek, ki določa natančno zaporedje nukleotidov DNK. Obstajajo različne metode sekvenciranja DNK. Maxam Gilbert sekvenciranje in Sanger DNA sekvenciranje sta dve metodi sekvenciranja DNA, ki spadata v prvo generacijo sekvenciranja. Postopek sekvenciranja po Maxamu Gilbertu določa bazno zaporedje s kemično cepitvijo fragmentov DNA, označenih s 5' koncem, prednostno na vsakem od štirih nukleotidov in elektroforezo v gelu. Sangerjev postopek sekvenciranja določa nukleotidno zaporedje s sintezo enoverižne DNA z uporabo DNA polimeraze in dideoksinukleotidov ter gelske elektroforeze. To je ključna razlika med Maxamom Gilbertom in Sanger Sequencing.
Kaj je Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert sekvenciranje, znano tudi kot metoda kemičnega sekvenciranja, je tehnika, ki je bila razvita za določanje vrstnega reda nukleotidov v DNK. To metodo sta predstavila W alter Gilbert in Alan Maxam leta 1976 in je postala priljubljena, saj jo je mogoče izvajati neposredno s prečiščeno DNK. Metoda Maxama Gilberta spada v prvo generacijo sekvenciranja DNK in je bila prva metoda sekvenciranja, ki so jo znanstveniki široko uporabljali.
Osnovno načelo te metode je omejevanje končno označenih fragmentov DNK na specifičnih bazah s kemikalijami in pogoji, značilnimi za bazo, ter ločevanje označenih fragmentov z elektroforezo, kot je prikazano na sliki 01. Fragmenti so ločeni glede na na njihove velikosti na gelu. Ker so fragmenti označeni, je mogoče enostavno razbrati zaporedje molekule DNK.
Gilbertova metoda Maxam uporablja kemikalije, specifične za baze, za razbijanje DNK na določenih bazah. Dve pogosti kemikaliji, imenovani dimetilsulfat in hidrazin, se uporabljata za selektivni napad na purine oziroma pirimidine.
Metoda sekvenciranja po Maxamu Gilbertu se izvaja v več korakih, kot sledi.
- Čiščenje zaporedja DNA z uporabo restrikcijskih endonukleaz
- Označevanje koncev fragmentov DNK z dodajanjem radioaktivnih fosfatov
- Čiščenje označenih fragmentov iz neoznačenih z gelsko elektroforezo
- Ločevanje končno označene DNK v štiri epruvete in ločena obdelava z bazno specifičnimi kemikalijami
- Elektroforeza vsebine vsake epruvete na ločenih linijah na gelu in ločevanje fragmentov glede na njihovo dolžino.
- Detekcija fragmentov z avtoradiografom.
Slika 01: Maxam Gilbert Sekvenciranje
Kaj je Sangerjevo zaporedje?
Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki so jo leta 1977 razvili Frederick Sanger in njegovi sodelavci za določitev baznega zaporedja danega fragmenta DNK. Znana je tudi kot metoda sekvenciranja prekinitve verige ali dideoksi sekvenciranja. Ta metoda deluje na principu selektivne vključitve dideoksinukleotidov, ki končujejo verigo (ddNTP), kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP, s polimerazo DNA med sintezo enoverižne DNA, da se prekine tvorba verige. Dideoksinukleotidom manjkajo 3’ OH skupine za tvorbo fosfodiestrskih vezi s sosednjim nukleotidom. Zato se tvorba verige ustavi, ko se ddNTP vključi v novo nastajajočo verigo med sangerjevim sekvenciranjem.
Pri tej metodi se izvedejo štiri ločene reakcije sinteze DNA (PCR) v štirih ločenih epruvetah z eno vrsto ddNTP. Druge zahteve so dobavljene tudi za epruvete za PCR, vključno s primerji, dNTP, Taq polimerazo, posebnimi pogoji itd. Štiri ločene reakcije se izvajajo v štirih epruvetah s štirimi mešanicami. Po reakcijah PCR se nastali fragmenti DNA toplotno denaturirajo in ločijo z gelsko elektroforezo. Nato se fragmenti vizualizirajo z uporabo označenega (radioaktivnega ali fluorescentnega) primerja ali dNTP, kot je prikazano na sliki 02.
Slika 02: Sangerjevo zaporedje
Kakšna je razlika med Maxam Gilbert in Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert sekvenciranje je prva tehnika, razvita za sekvenciranje DNK. | Sangerjeva metoda sekvenciranja je bila uvedena po metodi sekvenciranja Maxama Gilberta. |
| Uporaba | |
| Ta metoda se redko uporablja. | Sangerjevo sekvenciranje se redno uporablja za sekvenciranje. |
| Uporaba nevarnih kemikalij | |
| Uporablja nevarne kemikalije. | Uporaba nevarnih kemikalij je v primerjavi z metodo Maxama Gilberta omejena. |
| Označevanje za odkrivanje | |
| Ta metoda uporablja radioaktivni P32 za označevanje koncev fragmentov DNK. | Sangerjevo sekvenciranje uporablja radioaktivno ali fluorescentno označene ddNTP. |
Povzetek – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert in Sanger sekvenciranje sta dve vrsti tehnik sekvenciranja DNK, ki spadata v prvo generacijo sekvenciranja DNK. Sekvenciranje po Maxamu Gilbertu je prva metoda, uvedena za sekvenciranje DNK leta 1976, izvaja pa se z lomljenjem končno označenih fragmentov DNK s kemikalijami, specifičnimi za baze. Zato je znano kot kemično sekvenciranje. Sangerjeva metoda sekvenciranja je bila predstavljena leta 1977 in temelji na reakcijah prekinitve verige, ki jih poganja ddNTP. Sangerjeva metoda zaporedja je priljubljena kot metoda Maxama Gilberta zaradi številnih pomanjkljivosti metode Maxama Gilberta, kot so pretirana poraba časa, uporaba nevarnih kemikalij itd. To je razlika med sekvenciranjem Maxama Gilberta in Sangerja.
