Ključna razlika med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške je v njihovem načinu ravnanja. Metoda sekvenciranja klon za klonom vključuje kartiranje kromosomov in kloniranje pred sekvenciranjem, medtem ko sekvenciranje s kloniranjem s puško izpusti korake kartiranja kromosomov in kloniranja med sekvenciranjem.
Kloniranje s sekvenciranjem klonov in kloniranje s sekvenciranjem puške sta dve metodi sodobnega sekvenciranja genoma. Sekvenciranje klon za klonom je bolj zanesljiva metoda sekvenciranja. Je pa metoda kloniranja s sekvenciranjem puške hitrejša in cenejša. Članek se osredotoča na subtilno razliko med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške.
Kaj je kloniranje s sekvenciranjem klonov?
Klon po klonskem sekvenciranju je metoda sekvenciranja genoma. Zahteva preslikavo vsakega kromosoma pred delitvijo DNK. Po preslikavi je treba DNK razdeliti na fragmente, dolge 150 kilobaz. Ti fragmenti so nato pripravljeni za sekvenciranje. Naslednji korak je vstavljanje fragmentov DNA v bakterijske umetne kromosome (BAC) in nato v bakterijske celice. Ker so fragmenti zdaj znotraj bakterijskih celic, se vsakič, ko se bakterije delijo, delijo tudi vstavljeni fragmenti DNK in proizvedejo veliko enakih kopij. Nato se DNK posameznega bakterijskega klona fragmentira na 500 baznih parov dolge fragmente. So manjši in prekrivajoči se fragmenti. Nato poteka sekvenciranje z vstavitvijo teh fragmentov v vektor z znanim zaporedjem DNK. Začenši z znanim zaporedjem vektorja, se zaporedje nadaljuje do neznanega zaporedja.
Po končanem sekvenciranju je potrebno identificirati področja prekrivajočih se sekvenc. Nato pride do spajanja fragmentov, da nastanejo večji fragmenti, prvotno predstavljeni v BAC. Nato sledi sestavljanje večjih fragmentov v kromosom v skladu z zemljevidom genoma.
Slika 01: Kloniranje s sekvenciranjem klonov
Pomembna prednost sekvenciranja klon za klonom je, da vnaprej pripravljen zemljevid genoma pomaga pri zanesljivem sestavljanju večjih fragmentov. Toda pomanjkljivost te metode sekvenciranja je, da je dolgotrajno ustvarjanje zemljevidov genoma in izdelava klonov. Vendar je bila ta metoda prednostna med projektom "Human Genome Project".
Kaj je kloniranje s sekvenciranjem puške?
Kloniranje s puško sekvenciranjem je metoda sekvenciranja, ki naključno razbije zaporedja DNK na številne majhne fragmente in ponovno sestavi zaporedje z opazovanjem prekrivajočih se regij. Večje genome sesalcev je težko klonirati in sestaviti. To je posledica njihove strukturne kompleksnosti in velikosti. Čeprav je metoda sekvenciranja klon za klonom zanesljiva, traja dolgo časa za sekvenciranje genomov kompleksnih organizmov. Zato je kloniranje s sekvenciranjem iz puške postalo zanesljiva, cenejša metoda sekvenciranja, ki jo je mogoče izvesti hitreje. Zato se sodobni znanstveniki zanašajo na to metodo zaporedja, da bi se lotili kompleksnih genomov.
Slika 02: Kloniranje s sekvenciranjem puške
Med kloniranjem z metodo sekvenciranja s puško ne pride do običajnega preslikave genoma in korakov kloniranja. Na začetku je celoten genom razdrobljen v različne velikosti od 20 kilobaz do 300 kilobaz. Nato se izvede sekvenciranje. Nato je treba z uporabo sofisticirane računalniške programske opreme sestaviti fragmente tako, da pogledamo prekrivajoča se področja.
Kloniranje s sekvenciranjem puške pomaga izboljšati natančnost obstoječih zaporedij genoma. Glavna prednost te metode je, da je veliko hitrejša in cenejša od metode sekvenciranja klon za klonom. Vendar ta postopek ne vključuje uporabe genetskega zemljevida. Zato je večja verjetnost, da pride do napak med sestavljanjem. Tako je to velika pomanjkljivost pri kloniranju z metodo zaporedja puške.
Kakšne so podobnosti med zaporedjem kloniranja po klonu in zaporedjem puške?
- Sekvenciranje klon za klonom in sekvenciranje puške sta dve metodi sekvenciranja genoma.
- Med obema tehnikama zaporedja poteka sestavljanje razčlenjenih fragmentov z identifikacijo prekrivajočih se regij.
- Poleg tega je razčlenitev DNK na manjše fragmente potrebna tako za kloniranje kot za sekvenciranje puške.
Kakšna je razlika med kloniranjem po klonskem zaporedju in sekvenciranjem puške?
Tehnika sekvenciranja kloniranja po klonu vključuje dva glavna koraka: preslikavo kromosomov in kloniranje. V nasprotju s tem kloniranje s sekvenciranjem puške ne sledi tema dvema korakoma; naključno razbije zaporedja DNK na veliko majhnih fragmentov in ponovno sestavi zaporedje z opazovanjem prekrivajočih se regij. Zato je to ključna razlika med sekvenciranjem klonov po klonih in sekvenciranjem puške. Zaradi tega dejavnika je sekvenciranje klon za klonom drag in dolgotrajen postopek, medtem ko je sekvenciranje kloniranje s puško hitrejše in cenejše.
Vendar je manj verjetno, da se bodo med kloniranjem po kloniranju pojavile napake med sestavljanjem. Zato ima visoko zanesljivost. Vendar pa je klon s sekvenciranjem puške sorazmerno manj zanesljiva tehnika. To je torej tudi pomembna razlika med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške.
Spodnja info-grafika predstavlja več informacij o razliki med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške.
Povzetek – Klon po zaporedju klonov v primerjavi s sekvenciranjem puške
Če povzamemo razliko med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške, sta sekvenciranje klon za klonom in sekvenciranje puško dve metodi sekvenciranja genoma. Vendar tehnika sekvenciranja klon za klonom vključuje kartiranje genoma in postopke kloniranja, medtem ko sekvenciranje kloniranje s puško ne. Torej, to je ključna razlika med sekvenciranjem klon za klonom in sekvenciranjem puške. Ker preslikava genoma poteka med sekvenciranjem klonov za klonom, je manj verjetno, da bi prišlo do napak med sestavljanjem zaporedij. Toda kloniranje s sekvenciranjem puške je veliko hitrejši in cenejši postopek. Vendar je sorazmerno manj zanesljiv. Sekvenciranje klon za klonom je bila prednostna metoda sekvenciranja med „projektom človeškega genoma“. Toda sodobni molekularni biolog se bolj zanaša na kloniranje s sekvenciranjem puške.
