Ključna razlika med prevajanjem zarez in polnjenjem koncev je v tem, da je prevajanje zarez proces, ki ustvarja označene sonde DNK za različne hibridizacijske reakcije, medtem ko je zapolnjevanje koncev tehnika, ki ustvarja otopene fragmente z dodajanjem nukleotidov v enoverižne previse.
Prevajanje vzdevka in polnjenje koncev sta dve tehniki, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Nick translacija se uporablja za označevanje sond za hibridizacijo, da se odkrijejo specifične nukleotidne sekvence. Končno polnilo se uporablja za izdelavo otopljenih fragmentov, ki so imeli lepljive konce z enoničnimi previsi. Obe tehniki sta zelo pomembni in se redno izvajata v laboratorijih za molekularne raziskave.
Kaj je Nick Translation?
Prevajanje Nicka je pomembna tehnika, ki se uporablja za pripravo označenih sond za različne molekularno biološke tehnike, kot so blotiranje, in situ hibridizacija, fluorescentna in situ hibridizacija itd. Je in vitro metoda označevanja DNK. DNA sonde se uporabljajo za identifikacijo specifičnih zaporedij DNA ali RNA. S pomočjo označene sonde je mogoče iz kompleksne mešanice nukleinske kisline označiti ali vizualizirati specifične fragmente. Zato so označene sonde pripravljene z različnimi tehnikami. Prevajanje Nicka je ena takšnih metod, ki proizvaja označene sonde s pomočjo encimov DNaza 1 in DNK polimeraza 1.
Slika 01: Nick Translation
Proces prevajanja Nicka se začne z aktivnostjo encima DNase 1. DNaza 1 uvaja zareze v fosfatno ogrodje dvoverižne DNK s cepitvijo fosfodiestrskih vezi med nukleotidi. Ko je nick ustvarjen, bo proizvedena prosta 3′ OH skupina nukleotida in nanjo bo deloval encim DNA polimeraza 1. 5' do 3' eksonukleazna aktivnost DNA polimeraze 1 odstrani nukleotide iz zareza v smeri 3' verige DNA.
Hkrati deluje polimerazna aktivnost encima DNA polimeraza 1 in dodaja nukleotide, ki nadomestijo odstranjene nukleotide. Če so nukleotidi označeni, bo prišlo do zamenjave z označenimi nukleotidi in bo označilo DNK za identifikacijo. Končno se lahko ta na novo sintetizirana označena DNK uporablja kot sonde v različnih reakcijah hibridizacije.
Kaj je končno polnjenje?
Polnjenje koncev je tehnika, ki se uporablja v molekularni biologiji za izdelavo otopelih fragmentov. Restrikcijska prebava proizvaja drobce s previsi. Ti fragmenti morda niso združljivi za vezavo v plazmidne vektorje. Vektorji so pogosto otopi, da se omogoči spajanje nezdružljivih koncev. Zato je mogoče fragmente s previsi otopiti z dodajanjem nukleotidov komplementarni verigi z uporabo previsa kot predloge za polimerizacijo. Ta postopek je znan kot končno polnjenje.
DNA polimeraze, kot sta Klenow fragment DNA polimeraze I in T4 DNA polimeraza, katalizirajo končno polnjenje. Dodajo nukleotide za zapolnitev (5′ → 3′) in žvečenje (3′ → 5′). Ko so lepljivi konci napolnjeni, postanejo topi in so pripravljeni za povezavo v vektor.
Poleg tega lahko polnjenje koncev uporabimo za označevanje molekul DNK. Lahko pa se uporablja le za označevanje molekul DNK z lepljivimi konci. V primerjavi s prevajanjem vzdevkov je polnjenje koncev bolj nežna metoda, ki redko povzroči prekinitve DNK.
Kakšne so podobnosti med prevodom vzdevka in izpolnitvijo konca?
- Prevajanje vzdevka in polnjenje koncev sta molekularno biološki tehniki.
- Uporabite jih lahko za označevanje sond.
- Oba sta in vitro
Kakšna je razlika med prevodom vzdevka in izpolnjevanjem konca?
Prevajanje Nicka je tehnika, ki ustvarja označene sonde za hibridizacijo. Nasprotno pa je polnjenje koncev tehnika, ki ustvarja tope fragmente za ligacijo v vektorje. Torej, to je ključna razlika med prevodom vzdevka in izpolnitvijo konca. Poleg tega prevod Nicka zahteva uporabo 5'-3' eksonukleazne aktivnosti, medtem ko končno polnjenje ne zahteva 5'-3' eksonukleazne aktivnosti.
Spodnja infografika podrobneje prikazuje razlike med prevodom vzdevka in izpolnjevanjem konca.
Povzetek – Prevod vzdevka v primerjavi s končnim izpolnjevanjem
Nickovo prevajanje je metoda, ki vključi radioaktivno označene nukleotide v DNK. Sintetizira označene sonde na podlagi aktivnosti encimov DNase 1 in DNA polimeraze 1 E. coli. Po drugi strani pa je končno polnjenje tehnika, ki proizvaja tope delce. Kadar imajo fragmenti lepljive konce (enoverižni previsi), jim je treba narediti otopljene konce, da se povežejo v vektorje. Končno polnjenje doda združljive nukleotide in ustvari topi končni fragmenti, da postanejo združljivi za ligacijo. To torej povzema razliko med prevodom vzdevka in izpolnitvijo konca.
