Razlika med Northern Southern in Western Blotting

2024 Avtor: Alex Aldridge | [email protected]. Nazadnje spremenjeno: 2023-12-17 13:49

Ključna razlika – severno proti južnemu proti zahodnemu blotiranju

Odkrivanje specifičnih zaporedij DNA, RNA in proteinov je bistveno za različne vrste študij v molekularni biologiji. Gel elektroforeza je tehnika, ki ločuje DNA, RNA in beljakovine glede na njihovo velikost. Iz profilov gela se s posebnimi tehnikami, imenovanimi blotiranje in hibridizacija z označenimi sondami, odkrije določeno zaporedje DNA, zaporedje RNA ali protein. Obstajajo tri različne vrste metod blotiranja, in sicer južni, severni in zahodni. Ključna razlika med Northern Southern in Western blottingom je v vrsti molekule, ki jo zazna iz vzorca. Southern blotting je metoda, ki zazna specifično zaporedje DNK iz vzorca DNK. Northern blotting je tehnika, ki zazna specifično zaporedje RNA iz vzorca RNA. Western blot je metoda, ki zazna specifično beljakovino iz vzorca beljakovine.

Kaj je Southern Blotting?

Southern blotting tehniko je leta 1975 razvil E. M. Southern za identifikacijo specifičnega zaporedja DNK iz vzorca DNK. To je prva tehnika blotiranja, uvedena v molekularni biologiji. Omogočil je odkrivanje specifičnih genov iz DNK, specifičnih fragmentov iz DNK itd. Tehnika Southern blotting vključuje več korakov. So naslednji.

1. DNK izoliramo iz vzorca in razgradimo z restrikcijskimi endonukleazami.
2. Prebavljeni vzorec se loči z elektroforezo v agaroznem gelu.
3. Fragmenti DNK v gelu so denaturirani v posamezne verige z uporabo alkalne raztopine.
4. Enovijačna DNK se s kapilarnim prenosom prenese na nitrocelulozno filtrirno membrano.
5. Prenesena DNK je trajno fiksirana na membrano.
6. Fiksna DNA na membrani je hibridizirana z označenimi sondami.
7. Nevezana DNK se z izpiranjem spere z membrane.
8. Rentgenski film je izpostavljen membrani in pripravljen je avtoradiograf.

Southern blotting se uporablja za različne vidike molekularne biologije. Uporaben je pri kartiranju RFLP, forenzičnih študijah, metilaciji DNK pri izražanju genov, odkrivanju mutiranih genov pri genetskih motnjah, prstnih odtisih DNK itd.

Slika 01: Southern Blotting tehnika

Kaj je Northern Blotting?

Northern blotting je metoda, zasnovana za odkrivanje specifičnega zaporedja RNA ali zaporedja mRNA iz vzorca za preučevanje izražanja genov. To tehniko so leta 1979 razvili Alwine, Kemp in Stark. Od tehnik južnega in zahodnega blotinga se razlikuje po več korakih. Vendar pa se ta tehnika izvaja tudi z gelsko elektroforezo, blotiranjem in hibridizacijo s posebnimi označenimi sondami in detekcijo. Northern blotting tehnika se izvaja na naslednji način.

1. RNA se ekstrahira iz vzorca in loči z gelsko elektroforezo.
2. RNA se prenese iz gela na bloting membrano in fiksira.
3. Membrana je obdelana z označeno sondo, pripravljeno iz cDNA ali RNA (sonda je komplementarna specifičnemu zaporedju v vzorcu).
4. Sondo inkubiramo z membrano, da se veže s specifičnim zaporedjem.
5. Nevezane sonde se sperejo.
6. Hibridizirane fragmente zazna avtoradiograf.

Northern blotting je pomembno orodje pri odkrivanju in kvantifikaciji hibridizirane mRNA, preučevanju razgradnje RNA, vrednotenju razpolovnega časa RNA, odkrivanju spajanja RNA, preučevanju izražanja genov itd.

Slika 02: Northern Blotting

Kaj je Western Blotting?

Western blot je metoda odkrivanja specifičnega proteina iz beljakovinske mešanice z uporabo označenega protitelesa. Zato je western blot znan tudi kot imunoblot. To tehniko so uvedli Towbin in drugi leta 1979 in se zdaj rutinsko izvaja v laboratorijih za analizo beljakovin. Koraki so naslednji.

1. Proteini so ekstrahirani iz vzorca
2. Beljakovine ločimo po velikosti z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu
3. Ločene molekule se z elektroporacijo prenesejo v PVDF membrano ali nitrocelulozno membrano
4. Membrana je blokirana za nespecifično vezavo s protitelesi
5. Prenesene beljakovine so vezane s primarnim protitelesom (encimsko označena protitelesa).
6. Membrana se spere, da se odstranijo nespecifično vezana primarna protitelesa
7. Vezana protitelesa zaznamo z dodajanjem substrata in zaznavanjem nastale obarvane oborine

Western blot je uporaben pri odkrivanju protiteles proti HIV v vzorcu človeškega seruma. Western blot se lahko uporablja tudi kot potrditveni test za okužbo s hepatitisom B in dokončni test za bolezen norih krav.

Slika 03: Western blotting

Kakšna je razlika med Northern Southern in Western Blotting?

Severno proti južnemu proti zahodnemu blotiranju
Vrsta zaznane molekule
Northern Blotting	Northern blotting zazna specifično zaporedje RNA iz vzorca RNA.
Southern Blotting	Southern blotting zazna specifično zaporedje DNK iz vzorca DNK.
Western Blotting	Western blotting zazna specifično beljakovino iz vzorca beljakovine.
Vrsta gela
Northern Blotting	To uporablja agarozni/formaldehidni gel.
Southern Blotting	To uporablja agarozni gel.
Western Blotting	To uporablja poliakrilamidni gel.
Metoda blottinga
Northern Blotting	To je kapilarni prenos.
Southern Blotting	To je kapilarni prenos.
Western Blotting	To je električni prenos.
Uporabljene sonde
Northern Blotting	cDNA ali RNA sonde, označene radioaktivno ali neradioaktivno.
Southern Blotting	DNK sonde so označene radioaktivno ali neradioaktivno.
Western Blotting	Primarna protitelesa se uporabljajo kot sonde.
Sistem zaznavanja
Northern Blotting	To se naredi z uporabo avtoradiografa ali zaznavanja svetlobe ali spremembe barve.
Southern Blotting	To se naredi z uporabo avtoradiografa, zaznavanja svetlobe ali spremembe barve.
Western Blotting	To se naredi z zaznavanjem svetlobe ali spremembe barve.

Povzetek – Severno vs Southern vs Western Blotting

Blotting je posebna tehnika, razvita za identifikacijo specifične DNA, RNA ali beljakovine iz vzorcev. Obstajajo trije ločeni postopki blotiranja, in sicer severni, južni in zahodni, za odkrivanje specifične vrste molekule. Northern blotting tehnika je zasnovana za odkrivanje specifičnega zaporedja RNA iz mešanice RNA. Southern blotting tehnika omogoča odkrivanje specifičnega zaporedja DNA iz vzorca DNA, western blotting tehnika pa je razvita za identifikacijo specifičnega proteina iz mešanice beljakovin.