Ključna razlika – kloniranje genov proti PCR
Sintezo številnih kopij DNK iz specifičnega fragmenta DNK imenujemo pomnoževanje DNK. Obstajata dva glavna procesa pomnoževanja DNK, in sicer kloniranje genov in PCR. Ključna razlika med kloniranjem genov in PCR je, da kloniranje genov proizvede več kopij specifičnega gena in vivo s konstruiranjem rekombinantne DNA in rastjo znotraj gostiteljske bakterije, medtem ko PCR proizvede milijone kopij specifičnega fragmenta DNA in vitro, ki je podvržen ponavljajočim se ciklom denaturacija in sinteza.
Kaj je kloniranje genov?
Kloniranje genov je tehnika, ki se uporablja za iskanje in razmnoževanje specifičnega gena iz ekstrahirane genomske DNK organizma s konstrukcijo rekombinantne DNK. Genomska DNK vsebuje na tisoče različnih genov, kodiranih za beljakovine. Ko je DNK ekstrahirana, vključuje vse možne gene, ki jih lahko nosi. Tehnika kloniranja genov je omogočila detekcijo specifičnega gena iz celotne DNK. Zato je kloniranje genov pomembno orodje v molekularni biologiji.
Izdelava genomske knjižnice organizma je bistvenega pomena pri kloniranju genov, če ni namiga o lokaciji ustreznega gena v DNK. Genomska knjižnica je izdelana po naslednjih korakih.
1. korak: Ekstrakcija celotne DNK iz organizma, ki vsebuje želeni gen.
2. korak: Omejevanje prebave ekstrahirane DNK za proizvodnjo majhnih obvladljivih fragmentov. Ta korak olajšajo restrikcijske endonukleaze.
3. korak: Izbira primernega vektorja in odpiranje vektorske DNA z uporabo istih restrikcijskih endonukleaz. Bakterijski plazmidi se pogosto uporabljajo kot vektorji za prenašanje tuje DNK. Plazmidi so majhni krogi DNK, ki se nahajajo v bakterijah.
Korak 4: Kombinacija vektorske DNK in fragmentirane DNK za proizvodnjo rekombinantne molekule DNK. Ta korak ureja DNA ligaza.
5. korak: Prenos molekul rekombinantne DNA v gostiteljske bakterije. Ta korak je znan kot preoblikovanje in se izvede z uporabo toplotnega šoka.
5. korak: Pregled transformiranih bakterijskih celic na gojišču. Na koncu procesa transformacije dobimo mešano populacijo transformiranih in netransformiranih gostiteljskih celic. Ker zanimivi gen vključuje le transformirane gostiteljske celice. Zato je treba izbrati transformirane celice. Izbor poteka s selektivnimi gojišči, ki vsebujejo antibiotike. Samo transformirane celice rastejo na tem presejalnem mediju, kar omogoča izbiro.
6. korak: Gojenje bakterij za izdelavo genske knjižnice. V tem koraku se transformirane gostiteljske celice vnesejo v svež medij kulture, ki zagotavlja optimalne zahteve za rast. Skupno število kolonij na ploščah s kulturo predstavlja genomsko knjižnico tega organizma.
Korak 7: Molekulo rekombinantne DNA, ki vsebuje gen, ki nas zanima, je treba pregledati iz tisočev kloniranih fragmentov rekombinantne DNA. To je mogoče doseči z uporabo sond, ki označujejo določen gen ali specifične beljakovine, ki izhajajo iz tega gena.
Ko se iz vseh kolonij identificira želeni gen, ki vsebuje bakterijsko kolonijo, je mogoče izdelati milijone kopij rekombinantnega plazmida, ki vsebuje gen.
Kloniranje genov se uporablja pri vzpostavljanju genskih knjižnic, proizvodnji posebnih beljakovin, vitaminov, antibiotikov, hormonov, določanju zaporedja in kartiranju genomov organizmov, izdelavi več kopij posameznikove DNK v forenziki itd.
Slika_1: Kloniranje genov
Kaj je PCR?
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je tehnika, ki ustvari veliko število kopij določenega fragmenta DNK. Eksponentno pomnoževanje specifičnega zaporedja DNA dobimo s PCR pod pogoji in vitro. Ta tehnika je zelo močno orodje v molekularni biologiji, saj lahko pomnoži majhen vzorec DNK v uporabno količino. PCR je predstavil Kary Mullis leta 1983 in ta nagrajeni izum je povzročil velik napredek v molekularni biologiji.
Tehnika PCR sledi ponavljajočim se reakcijam PCR, kot je prikazano na sliki 02. Ena reakcija PCR je sestavljena iz treh glavnih korakov, ki potekajo pri treh različnih temperaturah; denaturacija dvoverižne DNA pri 94 0C, žarjenje primerjev pri 68 0C in podaljšanje verige pri 72 0 C. Zato je treba pri izvajanju PCR vzdrževati visoko temperaturno nihanje za pravilno replikacijo. PCR se izvaja v napravi za PCR v epruvetah za PCR. Epruvete za PCR so napolnjene s pravilnimi mešanicami za PCR, ki vsebujejo matrično DNK, polimerazo Taq, primerje, dNTP in pufer. Denaturacija dvoverižne vzorčne DNA v enoverižno DNA se izvede s prekinitvijo vodikovih vezi med komplementarnimi bazami pri 94 – 98 0C. Nato so posamezne verige šablonske DNK izpostavljene primerjem. Zagotoviti je treba par primerjev (naprej in nazaj), ki morajo biti termostabilni, da prenašajo visoke temperature. Primerji so enoverižne kratke sekvence DNA, ki so komplementarne koncem ciljnega fragmenta DNA. V PCR se uporabljajo sintetični primerji. Primerji se vežejo s komplementarnimi bazami vzorčne DNK in sprožijo sintezo nove verige. Ta korak katalizira encim, imenovan Taq polimeraza; termostabilen encim DNA polimeraza, izoliran iz Thermus auqaticus. Ko so primerji in nukleotidi (gradniki) na voljo, polimeraza Taq konstruira novo verigo DNK, ki je komplementarna vzorčni DNK. Na koncu programa PCR opazujemo pomnožen fragment DNA z gelsko elektroforezo. Če je potrebna nadaljnja analiza, produkt PCR očistimo iz gela.
PCR je zelo uporaben za diagnosticiranje in spremljanje genetskih in pridobljenih bolezni, identifikacijo kriminalcev (na področju forenzike), proučevanje strukture in delovanja ciljnega segmenta DNK, sekvenciranje in kartiranje genomov organizmov, itd. PCR je med znanstveniki postal rutinska laboratorijska tehnika v raziskovalnih laboratorijih za medicinsko in molekularno biologijo, saj ima široko paleto aplikacij.
Slika_2: Verižna reakcija s polimerazo
Kakšna je razlika med kloniranjem genov in PCR?
Kloniranje genov proti PCR |
|
| Kloniranje genov je postopek izdelave več kopij specifičnega gena in vivo s pomočjo rekombinantne DNA in transformacije v gostiteljsko bakterijo. | Tehnika PCR proizvede več kopij določenega zaporedja DNK in vitro s ponavljajočimi se cikli reakcij PCR. |
| Zahteva za izdelavo rekombinantne DNA | |
| Proizvede se rekombinantna DNK, da se locira gen. | Rekombinantna DNK se ne proizvaja. |
| Potreba po delovni sili | |
| Ta postopek je delovno intenziven. | Intenzivni porod ni potreben. |
| In vivo ali In vitro proces | |
| Konstrukcija rekombinantne DNA je in vitro, pomnoževanje DNA pa in vivo. | Pomnoževanje DNK poteka popolnoma in vitro. |
Povzetek – kloniranje genov proti PCR
Kloniranje genov in PCR sta dve metodi, ki se uporabljata za pomnoževanje DNK. PCR je postopek in vitro, ki naredi več kopij DNK določenega fragmenta DNK brez uporabe rekombinantne DNK in gostiteljskega organizma. Kloniranje genov je predvsem proces in vivo, katerega rezultat je več kopij zainteresiranega gena v gostiteljskem organizmu s konstrukcijo rekombinantne DNA. To je razlika med kloniranjem genov in PCR.
