Ključna razlika – kloniranje proti podkloniranju
Kloniranje in subkloniranje sta molekularno biološka postopka, ki ustvarjata genetsko identične celice ali organizme, ki nosijo DNK ali gen, ki nas zanima. Kloniranje je tehnika, ki vključuje vstavljanje želenega gena ali DNK v vektor, njegovo replikacijo v gostiteljski bakteriji in proizvodnjo celic ali organizmov, ki so natančne kopije genetske zasnove. Subkloniranje je tehnika, ki vključuje vstavitev zanimivega gena, ki je že vstavljen v vektor, v sekundarni vektor, njegovo replikacijo znotraj gostiteljske bakterije in proizvodnjo genetsko identičnih kopij celic ali organizmov. Ključna razlika med kloniranjem in subkloniranjem je v tem, da pri kloniranju gen, ki nas zanima, ko je povezan v vektor, nadaljuje proces kloniranja, medtem ko se pri subkloniranju že kloniran gen, ki nas zanima, loči od starševskega vektorja in ponovno vstavi v vektor prejemnika in nadaljujte s postopkom.
Kaj je kloniranje?
Kloniranje je postopek, ki proizvaja genetsko enake organizme ali celice. V naravi se kloniranje zgodi v obliki nespolnega razmnoževanja. Če ni genetske rekombinacije ali spremembe, dobijo hčerinske celice enako genetsko sestavo staršev. Prokariontski in evkariontski organizmi ustvarjajo klone z binarno cepitvijo, brstenjem, mitozo itd. V molekularni biologiji je kloniranje genov ali specifičnih fragmentov DNK priljubljena metoda za preučevanje strukture in delovanja tega določenega dela DNK.
Glavni cilj molekularnega kloniranja je izdelava milijonov kopij genetsko identičnih celic ali organizmov, ki nosijo želeni fragment DNK (predvsem gene). Ustvarja organizme z natančnimi genetskimi kopijami drugega. Predvsem se specifični geni klonirajo v molekularnih študijah za pridobitev strukturnih in funkcionalnih informacij ter za določanje zaporedja DNA. Tudi za proizvodnjo specifičnih beljakovin ali izdelkov v velikem obsegu se kloniranje pogosto uporablja.
Postopek kloniranja
Osnovni koraki postopka kloniranja so naslednji.
- Identifikacija in izolacija zanimivega gena. (Pomnoževanje zanimivega gena s PCR).
- Restrikcijska prebava zanimivega gena (restrikcijska endonukleaza prereže gen).
- Omejitev prebave vektorske DNA. (Vektorska DNK je prav tako razrezana z uporabo iste restrikcijske endonukleaze).
- Vstavljanje gena v vektor in tvorba rekombinantne molekule.
- Transformacija rekombinantnega vektorja v gostiteljsko bakterijo.
- Izolacija in identifikacija transformiranih bakterij (plazmidni vektor mora vsebovati izbirni gen, najpogosteje gen za odpornost na antibiotike za presejanje transformiranih bakterij).
- Izražanje rekombinantnega gena znotraj gostitelja.
Slika_01: Postopek kloniranja
Kaj je podkloniranje?
Subkloniranje je postopek premikanja zanimivega gena iz enega vektorja v drugega vektorja, da vidimo izražanje gena, da pridobimo želeno funkcionalnost gena. Pri tej metodi sta vključena dva vektorja; in sicer nadrejeni vektor in ciljni vektor. Klonirani vstavki se pri podkloniranju ponovno premaknejo v drugi vektor. Cilj prenosa gena iz prvega vektorja v drugi vektor je pridobiti nekaj, česar prvi vektor ne bi mogel narediti, ali ponovno ločiti gen znotraj že kloniranega fragmenta DNK in ga izraziti samega. Pri tem postopku se na začetku uporabljajo restrikcijski encimi.
Postopek podkloniranja
Osnovni koraki podkloniranja so naslednji.
- S pomočjo restrikcijskih endonukleaz, ločitev zanimive DNA v donorskem plazmidu (starševski vektor).
- Pomnoževanje zanimive DNK s PCR.
- Čiščenje produkta PCR (zanimiva DNK) z gelsko elektroforezo.
- Odpiranje prejemnega plazmida z istimi restrikcijskimi endonukleazami, ki se uporabljajo za ločevanje zanimive DNA v matičnem plazmidu.
- Ligacija zanimive DNA (gena) v prejemni plazmid za ustvarjanje subkloniranega plazmida.
- Transformacija subkloniranega vektorja v kompetentno gostiteljsko bakterijo.
- Pregled transformiranih celic.
- Čiščenje plazmidne DNA in uporaba za sekvenciranje DNA ali izražanje genov za pridobitev želenih produktov.
Subkloniranje se izvede ob izolaciji enega gena iz klonirane skupine genov ali ko je treba gen, ki nas zanima, prenesti v uporaben plazmid, da bi videli natančno funkcijo gena, ki nas zanima.
Slika_02: Postopek podkloniranja
Kakšna je razlika med kloniranjem in podkloniranjem?
Kloniranje proti podkloniranju |
|
| Kloniranje je postopek, ki proizvaja genetsko enake organizme ali celice. | Subkloniranje je postopek premikanja gena, ki nas zanima, iz enega vektorja v drugega, da vidimo izražanje gena, da pridobimo želeno funkcionalnost gena. |
| Proces | |
| Ločite zanimivo DNK od organizma in jo enkrat vstavite v vektor ter klonirajte | Že klonirana DNK je ločena od prvega vektorja in vstavljena v drugi vektor ter klonirana. |
| Vstavi gibanje prek vektorjev | |
| Ne premika vstavkov (DNK, ki nas zanima) iz enega vektorja v drugega. | Premakni vstavke iz nadrejenega vektorja v ciljni vektor. |
Povzetek – kloniranje proti podkloniranju
Kloniranje ustvari genetsko identične celice ali organizme z vstavljenim genom ali DNK, ki nas zanima. Poteka z ločevanjem in vstavljanjem DNK, ki nas zanima, v vektor in izražanjem v gostiteljski bakteriji. Podkloniranje ima podobne korake kot kloniranje. Vendar pa se pri subkloniranju že kloniran fragment DNA (zanimiv gen) vstavi v vektor in transformira v gostiteljsko bakterijo. To je ključna razlika med kloniranjem in podkloniranjem.
