Ključna razlika – izbirni marker v primerjavi s reporterskim genom
Tehnologija genskega inženiringa se uporablja za prenos pomembnih genov iz organizma v drug organizem. Vstavljanje tujega gena v genom drugega organizma in njegovo izražanje v gostiteljski celici sta najtežja koraka pri prenosu gena. Za odkrivanje uspeha transformacijskega procesa se v rekombinantni molekuli uporabita izbirni marker in reporterski gen. Izbirni marker je zaporedje DNK ali gen, ki izraža in izbira transformirane celice iz netransformiranih celic. Reporterski gen je še en gen, ki se uporablja za razlikovanje transformiranih celic in za količinsko opredelitev ali odkrivanje delovanja vstavljenega gena v gostitelju. Ključna razlika med izbirnim markerjem in reporterskim genom je v tem, da se izbirni marker uporablja za izločanje netransformiranih celic in signaliziranje transformiranih celic, medtem ko se reporterski gen uporablja za količinsko opredelitev ravni izražanja genov v gostitelju.
Kaj je izbirni marker?
V genskem inženiringu se gen, ki nas zanima, vstavi v ustrezen vektor in transformira v gostiteljske organizme. Vendar pa je transformacija uspešna le v kompetentnih gostiteljskih celicah in obstaja možnost, da gostiteljske celice zavrnejo prevzem tuje DNK. Zato je diferenciacija transformiranih in netransformiranih celic pomembna za nadaljevanje nadaljnjega eksperimentiranja. Zato raziskovalci vključijo izbirni markerski gen v vektor za enostavno izbiro transformiranih celic iz netransformiranih celic. Izbirni marker je zaporedje DNA, zlasti gen, uporaben pri identifikaciji transformiranih celic. Ta markerski gen kaže lastnost, ki ustreza umetni selekciji transformiranih celic iz netransformiranih celic na gojišču.
Najpogostejši izbirni markerji, ki se uporabljajo v molekularni biologiji, so geni, odporni na antibiotike. Gen za odpornost na antibiotike se vstavi v vektor in transformira v gostiteljske celice, zlasti v gostiteljsko bakterijo. Ta določen antibiotik je vključen v rastni medij bakterije. Zaradi prisotnosti selektivnega markerja lahko v selektivnih pogojih preživijo le celice, ki vsebujejo ustrezen selektivni marker. Netransformirane celice ne morejo rasti v mediju, ki vsebuje antibiotik. Zaradi izbirnega označevalca, ki je odporen na antibiotike, so transformirane celice zlahka identificirane.
Geni, ki dajejo lastnosti za antimetabolite, herbicide, se uporabljajo kot selektivni označevalci pri vektorjih za kloniranje v genskem inženiringu rastlin. Vendar pa ima ta kotransformacija selektivnih markerjev v gensko spremenjene organizme negativne učinke na okolje in človeka. Sprostitev bakterij, odpornih na antibiotike, lahko poveča odpornost človeških patogenov na antibiotike. Lahko kontaminira proizvod ali biomaso z antibiotiki in lahko izgubi selektivni pritisk zaradi razgradnje in inaktivacije antibiotikov.
Slika 01: Plazmidni vektor za prenos genov z izbirnim markerjem
Kaj je reporterski gen?
Reporterski geni so geni, ki omogočajo detekcijo ali merjenje ekspresije vstavljenega gena. Ti reporterski geni se lahko pritrdijo na regulatorne sekvence gena, ki nas zanima, da signalizirajo lokacijo ali nivoje izražanja. Zato se med izražanjem genov pod istim promotorjem le-ti prepišejo v eno samo zaporedje mRNA in nato prevedejo v protein, ki lahko kaže na stopnjo izražanja genov.
Reporterski geni so različnih vrst in vsebujejo vizualno prepoznavne značilnosti, ki so običajno vključene v fluorescentne in luminescentne proteine. Geni, ki kodirajo fluorescentne beljakovine in encime, pretvarjajo nevidne substrate v luminescentne ali obarvane produkte tako, da signalizirajo uspešno izražanje genov in dajo možnost kvantifikacije izražanja genov.
Slika 02: Ekspresija reporterskega gena
Kakšna je razlika med Selectable Marker in Reporter Gene?
Izbirni marker proti reporterskemu genu |
|
| Izbirni marker je neke vrste zaporedje DNK, ki pomaga razlikovati transformirane celice od netransformiranih celic. | Reporterski gen je gen, ki pomaga kvantificirati izražanje želenega gena, vstavljenega v gostiteljsko celico. |
| Narava proizvedenih enot | |
| Geni so kodirani z značilnostmi, ki pomagajo pri umetni selekciji na gojiščih. | Geni so kodirani z vizualno prepoznavnimi lastnostmi. |
| Uporaba | |
| Geni za odpornost na antibiotike, geni za antimetabolite, geni za odpornost na herbicide itd. so primeri izbirnih markerjev. | Primeri so geni, kodirani za zelene fluorescentne beljakovine, β-glukuronidazo, kloramfenikol acetiltransferazo, rdeče fluorescentne beljakovine itd. |
Povzetek – Izbirni označevalec v primerjavi s reporterskim genom
Izbirljivi označevalci omogočajo rast transformiranih celic v selektivnem mediju, doziranem z določenim antibiotikom ali herbicidom. Uporabljajo se za zgodnjo selekcijo transformiranih celic. Reporterski geni se uporabljajo za kvantificiranje stopnje izražanja želenega vstavljenega gena. Omogočajo tudi razlikovanje transformiranih in netransformiranih celic. To je razlika med izbirnim markerjem in reporterskim genom. Tako izbirni marker kot reporterski gen veljata za pomembna markerja v genskem inženirstvu.
