Ključna razlika – PCR proti replikaciji DNA
Podvajanje DNK je naraven proces, ki poteka v živih organizmih. Vključuje proizvodnjo dveh enakih kopij ene molekule DNK. Replikacija DNK je izjemno pomemben proces biološkega dedovanja. Genetske informacije se prenašajo s staršev na potomce predvsem zaradi sposobnosti podvajanja DNK. Zato je bistven proces, ki se pojavlja v skoraj vseh živih organizmih. Ta proces poteka in vivo. Vendar pa je replikacijo DNK mogoče izvesti tudi z metodami in vitro. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je ena takšnih in vitro metod podvajanja DNA. PCR je metoda pomnoževanja DNK, ki se izvaja v laboratorijih. Proizvaja na tisoče do milijone kopij DNK iz želenega fragmenta DNK ali gena. Obstajajo razlike med replikacijo DNA in vivo in PCR. Ključna razlika med tema dvema je, da se PCR izvaja v napravi za PCR pri vzdrževanih temperaturah, da se proizvede veliko število kopij DNK, medtem ko se replikacija DNK zgodi v telesu pri telesni temperaturi, da se proizvedejo dve enaki kopiji ene same molekule DNK.
Kaj je PCR?
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je in vitro tehnika pomnoževanja DNA, ki se redno izvaja v laboratorijih za molekularno biologijo. Ta metoda je omogočila izdelavo na tisoče do milijonov kopij posebej zanimivega fragmenta DNK. PCR je uvedel Kary Mullis leta 1980. Pri tej tehniki je želeni fragment DNK uporabljen kot predloga za izdelavo kopij. Encim, imenovan Taq polimeraza, se uporablja kot encim DNA polimeraza in bo kataliziral sintezo novih verig fragmenta DNA. Primerji, ki so v mešanici PCR, bodo delovali kot izhodišča za podaljške fragmentov. Na koncu reakcije PCR je mogoče pridobiti veliko kopij vzorčne DNK.
V mešanici PCR so vključene vse sestavine, ki so potrebne za izdelavo kopij DNK. So vzorčna DNK, DNK polimeraza (Taq polimeraza), primerji (naprej in nazaj), nukleotidi (gradniki DNK) in pufer. Reakcijo PCR izvajamo v napravi za PCR, hraniti pa jo je treba s pravilno mešanico PCR in pravilnim programom PCR. Če sta reakcijska zmes in program pravilna, bo proizvedel zahtevano količino kopij določenega dela DNK iz zelo majhne količine DNK.
V reakcijo PCR so vključeni trije glavni koraki, in sicer denaturacija, žarjenje primerja in podaljšek verige. Ti trije koraki potekajo pri treh različnih temperaturah. DNK obstaja kot dvoverižna vijačnica. Dve verigi sta povezani z vodikovimi vezmi. Pred pomnoževanjem se dvoverižna DNK loči z visoko temperaturo. Pri visoki temperaturi se dvoverižna DNA denaturira v enojne verige. Nato se primerji prižgejo z bočnimi konci želenega fragmenta ali gena DNK. Primer je kratek del enoverižne DNK, ki je komplementaren koncem ciljnega zaporedja. Prednji in povratni primerji se žarijo s komplementarnimi bazami na stranskih koncih denaturirane vzorčne DNK pri temperaturi žarjenja.
Ko so primerji žarjeni z DNK, encim polimeraza Taq sproži sintezo novih verig z dodajanjem nukleotidov, ki so komplementarni vzorčni DNK. Taq polimeraza je toplotno stabilen encim, ki je izoliran iz termofilne bakterije, imenovane Thermus aquaticus. Pufer PCR ohranja optimalne pogoje za delovanje polimeraze Taq. Te tri stopnje reakcije PCR se ponavljajo, da se proizvede potrebna količina produkta PCR. Pri vsaki reakciji PCR se število kopij DNK podvoji. Zato je pri PCR mogoče opaziti eksponentno pomnoževanje. Produkt PCR je mogoče opazovati z gelsko elektroforezo, saj proizvede vidno količino DNA na gelu in ga je mogoče očistiti za nadaljnje študije, kot je sekvenciranje itd.
Slika 01: PCR
PCR je dragoceno orodje v medicinskih in bioloških raziskavah. Zlasti v forenzičnih študijah ima PCR izjemno vrednost, saj lahko pomnoži DNK za študije iz majhnih vzorcev kriminalcev in naredi forenzične profile DNK. PCR se pogosto uporablja na številnih področjih molekularne biologije, vključno z genotipizacijo, kloniranjem genov, odkrivanjem mutacij, sekvenciranjem DNK, mikromrežami DNK in testiranjem očetovstva itd.
Kaj je replikacija DNK?
Podvajanje DNK se nanaša na proces, ki proizvede dve enaki kopiji DNK iz ene molekule DNK. Je pomemben proces biološkega dedovanja. Replikacija DNK poteka v vseh živih organizmih. Genom starševske celice je treba podvojiti, da se genom preda hčerinski celici. Proces replikacije DNA ima tri glavne korake, imenovane iniciacija, elongacija in terminacija. Te korake katalizirajo različni encimi. Replikacija DNK se začne na mestu, imenovanem izvor replikacije v genomu celice. V genomu DNK obstaja v dvoverižni obliki. Ti dve verigi sta ločeni na začetku replikacije DNK, izvede pa jo ATP odvisna DNK helikaza. Odvijanje DNK je glavni dogodek, ki se zgodi v iniciacijskem koraku. Z uporabo ločenih pramenov DNA kot matric DNA polimeraza sintetizira nove komplementarne verige matričnih pramenov v smeri od 5' do 3'. To je korak, imenovan raztezek. Do prekinitve pride, ko se replikacijske vilice srečajo druga z drugo na nasprotnem koncu starševskega kromosoma.
Slika 02: Replikacija DNK
Poleg DNK polimeraze je več encimov, kot so DNK primaza, DNK helikaza, DNK ligaza in topoizomeraza, vključenih v replikacijo DNK. Posebnost replikacije DNK in vivo je, da proizvaja Okazakijeve fragmente. En pramen se oblikuje neprekinjeno, drugi pa v majhnih koščkih.
Kakšne so podobnosti med PCR in replikacijo DNK?
- Tako pri PCR kot pri replikaciji DNK je dvoverižna DNK ločena druga od druge.
- V obeh procesih PCR in replikacije DNK se DNK kopira.
- Postopki replikacije PCR in DNK so zelo pomembni.
- V obeh procesih PCR in replikacije DNA je vključen encim DNA polimeraza.
Kakšna je razlika med PCR in replikacijo DNK?
PCR proti replikaciji DNA |
|
| PCR je in vitro metoda pomnoževanja DNK, pri kateri se proizvede na tisoče do milijonov kopij DNK. | Podvajanje DNK je naravni proces, ki proizvede dve enaki kopiji DNK iz ene molekule DNK. |
| Koraki | |
| PCR ima tri korake; denaturacija, žarjenje primerja in podaljšanje pramena. | Podvajanje DNK ima tri korake; začetek, raztezek in zaključek. |
| Vključevanje začetnikov | |
| PCR potrebuje umetne začetnike. | Replikacija DNK ne potrebuje umetnih primerjev. Kratek fragment RNK je vključen v replikacijo DNK. |
| Denaturacija dvojnih pramenov | |
| Dvojne niti se ločijo z uporabo visoke temperature v PCR. | Dvojne verige so med seboj ločene z encimom DNA helikaza pri replikaciji DNA. |
| Vključen encim | |
| PCR uporablja polimerazo Taq. | Podvajanje DNA uporablja DNA polimerazo. |
| Temperatura | |
| PCR poteka pri treh različnih temperaturah znotraj naprave. | Replikacija DNK poteka pri telesni temperaturi v telesu živega organizma. |
| In vivo ali In vitro | |
| PCR je metoda in vitro. | Podvajanje DNK je metoda in vivo. |
Povzetek – PCR proti replikaciji DNA
Podvajanje DNK je proces izdelave dveh identičnih kopij DNK iz ene same molekule DNK. Pojavlja se v vseh živih organizmih, saj ponuja metodo prenosa genetskih informacij od staršev do potomcev. Sestavljen je iz treh encimsko kataliziranih stopenj, in sicer iniciacije, elongacije in prekinitve. Replikacijo DNK lahko izvedemo umetno v laboratoriju. PCR je eden od načinov za izdelavo velikega števila kopij DNK iz želene DNK. PCR se redno izvaja v laboratorijih za molekularno biologijo, saj je preprosta metoda za izdelavo kopij DNK. To je razlika med PCR in replikacijo DNK.
