Ključna razlika – topla proti hladni tripsinizacija
Topla in hladna tripsinizacija sta dve metodi, ki se uporabljata pri encimski razgradnji celic pri gojenju živalskih celic. Ključna razlika med toplo in hladno tripsinizacijo, kot nakazujejo imena, je odvisna od temperature, pri kateri se doda tripsin za celično razgradnjo. Topla tripsinizacija poteka pri višjih temperaturah (36,5 – 37 0C), medtem ko hladna tripsinizacija poteka pri nizkih temperaturah.
Med procesom primarnega gojenja živalskih celic se uporabljajo tri glavne metode, ki so se izkazale za uspešne. Tri metode vključujejo mehansko razgradnjo celic, encimsko razgradnjo celic in tehniko primarne eksplantacije. Encimska razgradnja celic, ki vodi do izolacije celic, izvede pa jo encim tripsin, ki razgrajuje beljakovine. Zato je ta proces znan kot tripsinizacija. Tripsinizacijo lahko izvedemo pod dvema različnima pogojema, in sicer toplo tripsinizacijo in hladno tripsinizacijo. Topla tripsinizacija je metoda obdelave celic s tripsinom v toplih pogojih pri temperaturi 36,5 – 37 0C. Hladna tripsinizacija je postopek obdelave s tripsinom, ki poteka v hladnejših pogojih, po možnosti v ledu, ki vzdržuje zelo nizke temperature.
Kaj je topla tripsinizacija?
Tripsinizacijo je mogoče izvesti za razčlenitev celičnih komponent, da bi izolirali celice za proizvodnjo primarne celične kulture. Tripsin je encim za razgradnjo beljakovin in mešanica encimov, uporabljena pri tripsinizaciji, je lahko surovi ekstrakt ali prečiščen produkt. Surovi ekstrakt naj bi bil učinkovitejši pri razgradnji beljakovin in razgradnji celic, saj vsebuje druge razgradne encime.
Topla tripsinizacija je najpogosteje uporabljena encimska metoda za razgradnjo celic, ki poteka v pogojih višje temperature. Pred obdelavo s tripsinizacijo želeno tkivo nasekljamo na manjše kose. Olajša enostaven postopek razčlenjevanja. Narezano tkivo nato speremo v posebnem mediju, znanem kot medij za disekcijsko bazalno sol.
Po zaključku koraka pranja se celice pretvorijo v bučko, ki vsebuje aktivni encim, ki je tripsin. Ker ta tehnika vključuje protokol tople tripsinizacije, se tripsin za približno štiri ure postavi na temperaturo okoli 37 0C.
Slika 01: Tripsin
Vsebina je mešana in premešana z uporabo metod centrifugiranja za lažji protokol in pospešitev procesa razčlenitve. Ko je priporočeni čas dosežen, lahko celice pridobimo iz supernatanta. Celice, pridobljene iz supernatanta, se nato inkubirajo pri določeni temperaturi in času.
Kaj je hladna tripsinizacija?
Hladna tripsinizacija je druga vrsta tripsinizacije, ki poteka v hladnih razmerah. Pri tej tehniki se celice, ki so sesekljane in oprane, dajo v viale na led in nato namočijo s tripsinom. Čas namakanja je precej daljši – približno 6 – 24 ur.
Po končanem postopku namakanja se tripsin odstrani iz celičnega lizata, koščki tkiva pa se nadalje inkubirajo pri 37 0C približno 20 – 30 minut. Razčlenitev celic se izvede s ponavljajočim se pipetiranjem tkivne mešanice. To bo omogočilo celicam, da se ločijo od membrane in pridejo v supernatant. Ko so celice v supernatantu, se inkubirajo in gojijo pri želeni temperaturi in časovnem obdobju.
Metoda hladne tripsinizacije ima več prednosti
- Večji donos živih celic, saj je poškodba celic minimalna. Poškodbe celic so zmanjšane, če ne uporabljate korakov centrifugiranja.
- Zelo priročna metoda.
- Manj naporno.
Glavna omejitev metode hladne tripsinizacije je, da velikih količin ni mogoče uporabiti v enem primeru.
Kakšne so podobnosti med toplo in hladno tripsinizacijo?
- Postopki tople in hladne tripsinizacije uporabljajo encim tripsin za razgradnjo celic.
- Postopki tople in hladne tripsinizacije se uporabljajo v postopkih celične kulture za razčlenitev celic.
- Pri postopkih zdravljenja s toplo in hladno tripsinizacijo so celice pridobljene iz supernatanta.
Kakšna je razlika med toplo in hladno tripsinizacijo?
Topla proti hladni tripsinizaciji |
|
| Topla tripsinizacija je metoda obdelave celic s tripsinom v toplih pogojih pri temperaturi 36,5 – 37 0. | Hladna tripsinizacija je proces obdelave s tripsinom, ki poteka v hladnejših pogojih, po možnosti v ledu, ki vzdržuje zelo nizke temperature. |
| Protokol | |
| Narezane koščke tkiva vzdržujemo pri 37 0C ves čas postopka. | Sesekljane koščke tkiva se najprej vzdržujejo pri ledeno mrzlih temperaturah, nato pa pri 37 0. |
| Temperatura | |
| Topla tripsinizacija se pojavi pri 36,5 – 37 0 | Hladna tripsinizacija se pojavi pri ledeno nizkih temperaturah. |
| Porabljen čas | |
| Manj časa, potrebnega za celoten postopek (približno 4 ure) tople tripsinizacije. | Potreben je daljši čas (približno 6 – 24 ur) za hladno tripsinizacijo. |
| Donos živih celic | |
| Nizka toplotna tripsinizacija. | Visoko pri hladni tripsinizaciji. |
| Uporaba centrifugiranja | |
| Centrifugiranje je potrebno za razgradnjo celic pri topli tripsinizaciji. | Centrifugiranje pri hladni tripsinizaciji ni potrebno. |
| Začetna količina tkiva za tripsinizacijo | |
| Pri topli tripsinizaciji lahko uporabimo večjo količino tkiva. | Pri hladni tripsinizaciji lahko uporabimo manjšo količino tkiva. |
| Poškodbe celic | |
| Visoka zaradi centrifugiranja pri topli tripsinizaciji. | Manj zaradi hladne tripsinizacije. |
Povzetek – Topla proti hladni tripsinizaciji
Tripsinizacija je metoda uporabe encima tripsina, ki razgrajuje beljakovine, za razgradnjo in pripravo primarnih celičnih kultur med procesom gojenja celic. Obstajata dve glavni tehniki tripsinizacije, ki temeljita na temperaturah, uporabljenih med postopkom. So topla in hladna tripsinizacija. Topla tripsinizacija se izvaja pri 37 0C, medtem ko se hladna tripsinizacija izvaja v ledeno mrzlih pogojih. Čeprav hladna tripsinizacija traja dlje časa za dokončanje, naj bi imela večji donos živih celic. To je posledica dejstva, da je poškodba celic pri hladni tripsinizaciji čim manjša, saj ne uporablja močnih korakov centrifugiranja. To je razlika med toplo in hladno tripsinizacijo.
