Ključna razlika – SYBR Green proti Taqmanu
SYBR Green in Taqman sta dve metodi, ki se uporabljata za odkrivanje ali opazovanje procesa pomnoževanja PCR v realnem času. SYBR Green je metoda, ki temelji na interkalacijskem barvilu za barvanje z nukleinsko kislino, medtem ko je Taqman metoda, ki temelji na hidrolizni sondi. Obe tehnologiji sta zasnovani za ustvarjanje fluorescence med PCR, kar omogoča stroju za PCR v realnem času spremljanje reakcije v "realnem času". Metoda SYBR Green se izvaja z uporabo fluorescenčnega barvila, imenovanega SYBR green, in zazna pomnoževanje z vezavo barvila na proizvedeno dvoverižno DNA. Taqman se izvaja z uporabo dvojno označenih sond in zazna pomnoževanje z razgradnjo sonde s polimerazo Taq in sproščanjem fluoroforja. To je ključna razlika med SYBR Green in Taqmanom.
Kaj je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescentno barvilo, ki se uporablja za barvanje nukleinskih kislin, zlasti dvoverižne DNK v molekularni biologiji. Metoda SYBR Green se uporablja za kvantifikacijo produktov PCR med PCR v realnem času. Ko se nastali kompleks DNK-barvilo veže na DNK, absorbira modro svetlobo in oddaja intenzivno zeleno svetlobo. Zgodi se zaradi strukturne spremembe, ki nastane v molekuli barvila ob vezavi na dvoverižno DNA. Ko PCR ustvari vedno več DNK, se več molekul barvila veže na DNK, kar povzroči več fluorescence. Zato se fluorescenca poveča s kopičenjem produkta PCR. Zato je mogoče količino produkta PCR kvantitativno izmeriti z detekcijo fluorescence SYBR Green.
Zeleno barvilo SYBR se lahko uporablja tudi za označevanje DNK v citometriji in fluorescentni mikroskopiji. Etidijev bromid je uspešno nadomestil SYBR Green, saj je etidijev bromid rakotvorno barvilo s težavami pri odstranjevanju med vizualizacijo DNK v gelski elektroforezi.
Obstajajo prednosti in slabosti zelene metode SYBR. Ta metoda je zelo občutljiva, poceni in enostavna za uporabo. Vendar pa lahko nespecifična vezava zaradi svoje sposobnosti vezave na katero koli dvoverižno DNK vodi do prekomerne kvantifikacije produkta PCR.
Slika 01: Zelena tehnika SYBR
Kaj je Taqman?
Taqman je alternativna metoda za SYBR Green za spremljanje procesa PCR v realnem času. Ta metoda je odvisna od 5'-3' eksonukleazne aktivnosti encima polimeraze Taq za razgradnjo sond med podaljševanjem nove verige in sproščanjem fluoroforja. Pri tej metodi se uporabljajo dvojno označene sonde in temelji na hidrolizi sond. Sonde so fluorescenčno označeni oligonukleotidi DNA, ki imajo fluorescentno reportersko molekulo (fluorofor) na 5' koncu in dušilno molekulo na 3' koncu. Zasnovani so tako, da se vežejo na enovijačno šablono na nasprotni strani žarjenja primerja. Polimeraza Taq doda nukleotide v začetni sloj in razširi novo verigo proti dvojno označenim sondam. Ko se polimeraza Taq sreča s sondo, eksonukleazno delovanje polimeraze Taq aktivira in razgradi sondo. Ko konča sintezo nove verige, je sonda izpostavljena popolni razgradnji in sprosti fluorofor. Sprostitev fluoroforja povzroči fluorescenco. Molekula Fluorescent Quencher učinkovito duši oddano svetlobo in ustvari izhod za kvantifikacijo produkta PCR. Sproščanje fluoroforjev in količina produktov PCR sta sorazmerni. Kvantifikacijo je torej mogoče enostavno opraviti s Taqmanovo metodo.
Slika 02: Metoda Taqman
Taqmanova metoda se uporablja v PCR v realnem času, kvantifikaciji izražanja genov, detekciji genetskih polimorfizmov, kvantifikaciji delecij kromosomske DNK, identifikaciji bakterij, verifikaciji analize mikromrež, genotipizaciji SNP itd.
Kakšna je razlika med SYBR green in Taqman?
SYBR Green proti Taqmanu |
|
| SYBR Green temelji na barvilu, ki veže DNK. | Taqman je odvisen od hibridizacijskih sond in 5' do 3' eksonukleazne aktivnosti polimeraze Taq. |
| Fluorescentno označene sonde | |
| Fluorescentno označene sonde niso potrebne. | Potrebne so sonde z dvojno oznako. |
| Multipleksna analiza genov | |
| Ni ga mogoče uporabiti za multiple genske tarče. | Lahko se uporablja za multipleksne tarče genov. |
| Cost | |
| To je ceneje. | To je dražje. |
| Specifičnost | |
| To je manj specifično in se veže na katero koli dvoverižno DNA | Te so zelo specifične, saj sonde zaznavajo specifične produkte ojačanja. |
| Učinkovitost | |
| To je manj učinkovito. | To je zelo učinkovito. |
| Aplikacija | |
| To se uporablja pri PCR v realnem času, vizualizaciji z agaroznim gelom, označevanju DNK itd. | To se uporablja v PCR v realnem času, kvantifikaciji izražanja genov, odkrivanju genetskih polimorfizmov itd. |
Povzetek – SYBR Green in Taqman
Taqman in SYBR zelena sta dve metodi, ki se uporabljata v PCR v realnem času (kvantitativni PCR). Obe metodi omogočata učinkovito kvantifikacijo produkta PCR in temeljita na emisiji fluorescence. Metoda Taqman uporablja dvojno označene sonde za odkrivanje akumulirane DNK, medtem ko metoda SYBR Green uporablja fluorescentno barvilo. Obe metodi imata tudi različne aplikacije v molekularni biologiji.
