Ključna razlika – nitroceluloza proti PVDF
Western blot je metoda, ki omogoča odkrivanje in kvantifikacijo specifičnih beljakovin iz vzorca beljakovin. Zanesljivost tehnike je odvisna od izbire pravilne membrane za absorpcijo proteinov iz gela. Obstajajo različne vrste mikroporoznih membran. Nitrocelulozne in PVDF membrane sta dve takšni membrani, ki ju raziskovalci dajejo prednost zaradi svojih posebnih lastnosti pred drugimi vrstami membran. Izbira med nitrocelulozo ali PVDF je prav tako še en izziv pri Western blottingu. Nitroceluloza in PVDF imata visoko sposobnost absorpcije beljakovin. Ključna razlika med nitrocelulozno in PVDF membrano je v tem, da nitrocelulozne membrane nimajo sposobnosti odstranjevanja protiteles in ponovne uporabe membrane za ponovno testiranje protiteles, medtem ko imajo PVDF membrane sposobnost odstranjevanja in ponovne uporabe.
Kaj je nitroceluloza?
Nitroceluloza je polimer, proizveden z obdelavo celuloze z dušikovo kislino in se uporablja za izdelavo mikroporoznih membran v molekularni biologiji, zlasti za tehnike blotiranja, kot je južno, severno in zahodno blotiranje. Velikosti por nitroceluloznih membran so od 3 do 20 µm. Nitrocelulozne mikroporozne membrane olajšajo detekcijo imunokemične reakcije, ki se dogaja na površini membrane. Zato se nitrocelulozne membrane pogosto uporabljajo za imobilizacijo proteinov in detekcijo specifičnih proteinov pri western blotingu. Nitrocelulozne membrane lahko tudi imobilizirajo glikoproteine in nukleinske kisline.
Nitrocelulozne membrane so prednostne pri preskusih bočnega pretoka zaradi več lastnosti. Nitrocelulozne membrane absorbirajo beljakovine v visoki koncentraciji. Topilo, uporabljeno za vlaženje membrane, ne zmanjša absorpcije beljakovin nitrocelulozne membrane. Nitrocelulozne membrane je mogoče enostavno razrezati na želeno velikost gela in prenesti proteine iz gela na membrano z električnim ali kapilarnim prenosom. Nitroceluloza omogoča hitrejši pretok proteinov skozi membrano z visokim vezavnim potencialom. Nitroceluloza kaže izboljšano moč rokovanja. Druga posebna lastnost nitrocelulozne membrane je, da jo je mogoče enostavno prilepiti z vodoodpornimi lepili brez topil na različne plastične podlage.
Slika 01: Nitrocelulozna membrana za Western blotting
Kaj je PVDF?
Poliviniliden difluorid (PVDF) je fluoropolimer, proizveden s polimerizacijo viniliden difluorida in ima visoko sposobnost imobilizacije proteinov. Zato se mikroporozne membrane iz PVDF uporabljajo v western blotting tehnikah za analizo specifičnih proteinov iz mešanic proteinov. PVDF membrane se lahko uporabljajo tudi za analizo aminokislin in sekvenciranje beljakovin. Najpomembnejša značilnost PVDF membrane v primerjavi z nitrocelulozno membrano je, da jo je mogoče enostavno odstraniti z protiteles in ponovno uporabiti za naslednje sonde protiteles.
PVDF membrane so debelejše od nitroceluloznih membran; zato je bolj odporen na poškodbe med ponovno uporabo. PVDF membrane so zelo hidrofobne. Zato jih je treba pred uporabo namočiti v metanol ali izopropanol.
Kakšna je razlika med nitrocelulozo in PVDF?
Nitroceluloza proti PVDF |
|
| Nitroceluloza je polimer, sestavljen iz celuloze. | PVDF je fluoropolimer, proizveden s polimerizacijo viniliden difluorida. |
| Velikost por membrane | |
| Tipične velikosti por so 0,1, 0,2 ali 0,45μ | Tipične velikosti por so 0,1, 0,2 ali 0,45 μm |
| Zmožnost vezave beljakovin | |
| Nitroceluloza ima sposobnost vezave na beljakovine od 80 do 100 μg/cm2. | PVDF ima sposobnost vezave na beljakovine od 170 do 200 μg/cm2. |
| Občutljivost | |
| Ta ima nizko občutljivost v primerjavi s PVDF. | Ta ima visoko občutljivost. |
| Detekcija nizko izraženih beljakovin | |
| Ker je občutljivost nitroceluloznih membran nizka, ni primerna za detekcijo nizko izraženih proteinov. | To je bolj primerno za detekcijo nizko izraženih proteinov zaradi svoje visoke občutljivosti. |
| Hrup v ozadju | |
| To ima nižji hrup v ozadju | To ima večji hrup v ozadju. |
| Interakcije z beljakovinami | |
| Molekule beljakovin se vežejo na nitrocelulozne membrane s hidrofobnimi interakcijami. | Proteini se vežejo na PVDF membrane preko hidrofobnih in dipolnih interakcij. |
| Narava membrane | |
| Nitroceluloza je krhka in lomljiva. Vendar so na voljo različice nitroceluloze, ki so odporne. | PVDF je bolj vzdržljiv in ima večjo kemično odpornost. |
| Možnost odstranjevanja in ponovne uporabe | |
| Nitroceluloza ima lahko težave pri odstranjevanju in ponovnem testiranju brez izgube signala. | PVDF je idealen za aplikacije za ponovno testiranje in sekvenciranje. |
| Primernost | |
| Nitroceluloza je idealna za odkrivanje beljakovin z nizko molekulsko maso. | PVDF je bolj primeren za odkrivanje beljakovin z višjo molekulsko maso. |
| Druge uporabe | |
| Nitrocelulozo lahko uporabite za analizo nukleinske kisline in pikanje s pikami/režami. | PVDF se lahko uporablja za sekvenciranje beljakovin in testne sisteme na trdni fazi. |
| Cena | |
| To je cenejše od PVDF membran. | To je dražje od nitroceluloznih membran. |
| Potreba po predmočenju | |
| Nitrocelulozne membrane ne potrebujejo predhodnega namakanja z metanolom | PVDF membrane zahtevajo predhodno namakanje z metanolom. |
Povzetek – Nitroceluloza proti PVDF
Nitrocelulozne membrane so bile prve komercialno uporabljene membrane za analizo bočnega toka. Imajo visoko sposobnost absorpcije beljakovin. Zato se pri western blotingu uporabljajo nitrocelulozne membrane. PVDF je druga vrsta membrane, ki se uporablja pri western blotingu in ima tudi visoko sposobnost absorpcije beljakovin. Obe vrsti se uporabljata pri Western blottingu za analizo beljakovin. Vendar imajo PVDF membrane bolj posebne lastnosti, zaradi česar so bolj primerne kot nitrocelulozne membrane za Western blotting. Toda nitrocelulozne membrane so primernejše za odkrivanje proteinov z nizko molekulsko maso, membrane PVDF pa so bolj primerne za odkrivanje proteinov z visoko molekulsko maso. To je razlika med nitroceluloznimi in PVDF membranami.
