Ključna razlika – stran SDS v primerjavi z domačo stranjo
SDS in izvorna stran sta dve vrsti tehnik elektroforeze v poliakrilamidnem gelu, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Ključna razlika med SDS Page in Native Page je vrsta uporabljenega poliakrilamidnega gela. Na strani SDS je uporabljen denaturacijski gel, zato so molekule ločene glede na njihovo molekulsko maso. Nasprotno pa so v Native Page uporabljeni nedenaturacijski geli. Zato so molekule ločene glede na velikost, naboj in obliko.
Elektroforeza s poliakrilamidnim gelom (Page) uporablja gel, narejen s polimerizacijo akrilamidnih monomerov z metilen bisakrilamidom. Poliakrilamid je trši in toplotno stabilnejši od agaroze. Poliakrilamidni geli imajo manjše pore, kar omogoča učinkovito ločevanje beljakovin. Obstajata dve glavni vrsti nastavitev strani, in sicer stran SDS in izvorna stran. SDS Page ali elektroforeza s poliakrilamidnim gelom natrijevega dodecil sulfata ločuje beljakovine glede na njihovo molekulsko maso. Na strani SDS se uporabljajo denaturacijski geli. Native Page uporablja nedenaturirajoče gele in ločuje beljakovine glede na njihovo velikost, naboj in obliko (3D konformacija).
Kaj je stran SDS?
SDS Page je najpogostejša elektroforetska tehnika, ki se uporablja za ločevanje beljakovin na podlagi njihove molekulske mase. Gel je narejen z dodatkom SDS (Sodium dodecyl sulfate), ki je detergent. SDS proteine proteze pretvori v monomere. SDS je anionski detergent. Zato dodaja neto negativni naboj beljakovinam v širokem območju pH. Ko je neto negativni naboj pripisan beljakovinskim molekulam, se zaradi variacije naboja kompleksne strukture razgradijo. Zaradi negativnega naboja se proteini privlačijo proti pozitivnemu koncu. Tako molekule z nižjo molekulsko maso potujejo hitreje po matriksu gela in jih je mogoče opazovati blizu anode, medtem ko so proteini z večjo molekulsko maso opazovani bližje vdolbinicam.
Slika 01: Stran SDS
Vezava SDS na polipeptidno verigo je sorazmerna z njeno relativno molekulsko maso. Zato lahko molekulsko maso določimo tudi preko SDS Page. Barvanje gelov SDS Page se opravi z barvanjem z bromofenol modrim. Uporaba strani SDS je v večjem obsegu tam, kjer jo je mogoče uporabiti za oceno relativne molekulske mase in za določitev relativne številčnosti beljakovin v mešanici beljakovin. Stran SDS se lahko uporablja tudi za določanje porazdelitve beljakovin v mešanici beljakovin. Stran SDS se uporablja tudi za čiščenje in ocenjevanje beljakovin. Uporablja se kot predhodni postopek za western blot in hibridizacijo, ki se nato uporabljata za preslikavo in identifikacijo beljakovin.
Kaj je izvorna stran?
Naravna elektroforeza s poliakrilamidnim gelom (Native Page) uporablja nedenaturacijski gel. Zato SDS ali katero koli drugo sredstvo za denaturacijo ni dodano matrici gela. V Native Page ločevanje proteinov temelji na naboju in velikosti proteina. Zato je mobilnost proteina odvisna od naboja in velikosti proteina.
Naboj proteina je odvisen od stranskih verig aminokislin. Če so stranske verige negativno nabite, bo beljakovina prejela splošni negativni naboj in obratno. Proteini obdržijo 3D konformacijo zaradi zvijanja, ki se zgodi. Zlaganje je posledica več vrst vezi v proteinih, kot so disulfidne vezi, hidrofobne interakcije in vodikove vezi. Torej, če se domači Page prenaša pri nevtralnem pH, bodo proteini ločeni glede na molekularno obliko proteina. Zato se lahko Native Page uporablja kot občutljiva tehnika za zaznavanje spremembe naboja ali konformacije proteina.
Glavna prednost domačega Pagea je, da se lahko protein, uporabljen za Page analizo, povrne v prvotno stanje po Page analizi, saj protein med postopkom ni moten. Native Page je tehnika z relativno visoko zmogljivostjo in povečana je stabilnost proteina.
Slika 02: Izvorna stran
Po zaključku postopka gela si lahko gel Native Page ogledate z barvanjem z bromofenol modrim ali katerim koli drugim primernim reagentom za barvanje. Aplikacije Native Page vključujejo ločevanje kislih beljakovin, vključno z glikoproteini, kot je humani rekombinantni eritropoetin, ali identifikacijo beljakovin, prisotnih v govejem serumskem albuminu (BSA).
Kakšne so podobnosti med stranjo SDS in izvorno stranjo?
- Tako sistem SDS Page kot Native Page uporabljata poliakrilamidni gel kot matrico gela.
- Oboje se uporablja za ločevanje in identifikacijo proteinov.
- Oba uporabljata elektroforetično mobilnost za ločevanje spojin.
- Oboje je mogoče narediti na navpični ali vodoravni način (večinoma kot navpične nastavitve strani, ker je dolžina izvedbe večja).
- Aparat za elektroforezo, vključno z rezervoarjem za gel, glavniki, napajalnik je potreben za delovanje obeh tehnik.
- Vizualizacijo gela lahko izvedemo z metodami barvanja v obeh tehnikah.
Kakšna je razlika med stranjo SDS in izvorno stranjo?
Stran SDS proti domači strani |
|
| SDS Page ali Page z natrijevim dodecil sulfatom ločuje beljakovine glede na njihovo molekulsko maso in uporablja denaturacijski gel. | Native Page uporablja nedenaturirajoče gele in ločuje beljakovine glede na njihovo velikost, naboj in obliko (3D konformacija). |
| Vrsta gela | |
| Denaturacijski gel je uporabljen v SDS-strani. | Na domači strani je uporabljen nedenaturacijski gel. |
| Prisotnost SDS | |
| SDS je prisoten kot detergent za vnos negativnega naboja vzorcu na strani SDS. | SDS ni prisoten na domači strani. |
| Ločitvena osnova | |
| Ločevanje proteinov je odvisno od molekulske mase proteina na strani SDS. | Ločevanje je odvisno od velikosti in oblike proteinske molekule v izvorni strani. |
| Stabilnost beljakovin | |
| Stabilnost beljakovin je nizka na strani SDS. | Stabilnost beljakovin je visoka na domači strani. |
| Obnovitev prvotnega proteina | |
| Ni mogoče, ker je na strani SDS denaturirano. | Možno na domači strani. |
Povzetek – stran SDS v primerjavi z domačo stranjo
SDS Page in Native Page sta dve vrsti tehnik elektroforeze v poliakrilamidnem gelu, ki se uporabljata za ločevanje beljakovin. Stran SDS je obdelana z detergentom, imenovanim SDS. SDS daje beljakovini splošni negativni naboj, kar nato povzroči denaturacijo beljakovine. Zato so beljakovine ločene glede na njihovo molekulsko maso. Nasprotno pa tehnika Native Page ne uporablja nobenega sredstva za denaturacijo. Tako so beljakovine bodisi ločene glede na njihovo velikost ali obliko. To je razlika med stranjo SDS in domačo stranjo.
