Ključna razlika med CRISPR in restrikcijskimi encimi je, da je CRISPR naravno prisoten prokariontski imunski obrambni mehanizem, ki je bil pred kratkim uporabljen za urejanje in spreminjanje evkariontskih genov, medtem ko so restrikcijski encimi biološke škarje, ki cepijo molekule DNA v manjše snovi.
Urejanje genoma in spreminjanje genov sta zanimivi in inovativni področji v genetiki in molekularni biologiji. Študije genske terapije pogosto uporabljajo modifikacije genov. Poleg tega je modifikacija gena uporabna pri prepoznavanju lastnosti gena, funkcionalnosti gena in tega, kako lahko mutacije v genu vplivajo na njegovo delovanje. Pomembno je izpeljati učinkovite in zanesljive načine za natančne, ciljne spremembe v genomu živih celic. CRISPR in restrikcijski encimi igrajo ključno vlogo pri genskih spremembah. CRISPR modificira gene z visoko natančnostjo. Restrikcijski encimi delujejo kot biološke škarje, ki cepijo molekule DNK na manjše snovi.
Kaj je CRISPR?
Sistem CRISPR je naravni mehanizem, prisoten v nekaterih bakterijah, vključno z E. coli in Archea. Je prilagodljiva imunska zaščita pred tujimi vdori na osnovi DNK. Poleg tega je mehanizem, specifičen za zaporedje. Sistem CRISPR vsebuje več ponavljajočih se elementov DNK. Ti elementi so prepleteni s kratkimi "distančnimi" zaporedji, ki izhajajo iz tuje DNK in več genov Cas. Nekateri geni Cas so nukleaze. Tako se celoten imunski sistem imenuje sistem CRISPR/Cas.
Sistem CRISPR/Cas deluje v štirih korakih:
- Sistem, ki genetsko priveže invazivne fagne in plazmidne segmente DNK (distančnike) v lokuse CRISPR (imenovan korak pridobivanja presledkov).
- stopnja zorenja crRNA – Gostitelj prepisuje in obdeluje lokuse CRISPR, da ustvari zrelo RNK CRISPR (crRNA), ki vsebuje ponavljajoče se elemente CRISPR in integrirani distančni element.
- CrRNA zazna homologna zaporedja DNK s komplementarnim združevanjem baz. To je pomembno, ko je prisotna okužba in povzročitelj okužbe.
- Korak ciljne motnje – crRNA zazna tujo DNK, tvori kompleks s tujo DNK in zaščiti gostitelja pred tujo DNK.
Trenutno se sistem CRISPR/Cas9 uporablja za spreminjanje ali modificiranje genoma sesalcev z zatiranjem ali aktivacijo transkripcije. Celice sesalcev se lahko odzovejo na zlome DNK, ki jih posreduje CRISPR/Cas9, tako da sprejmejo mehanizem popravljanja. Izvede se lahko bodisi z metodo nehomolognega spajanja koncev (NHEJ) bodisi s homologno usmerjenim popravilom (HDR). Oba mehanizma popravljanja potekata z uvedbo dvoverižnih prekinitev. Posledica tega je urejanje genov sesalcev. NHEJ lahko povzroči ablacijo genskih mutacij in se lahko uporabi za ustvarjanje učinkov izgube funkcij. HDR se lahko uporablja za uvajanje specifičnih točkovnih mutacij ali uvajanje segmentov DNK različnih dolžin. Trenutno se sistem CRISPR/Cas uporablja na področjih terapevtskih, biomedicinskih, kmetijskih in raziskovalnih aplikacij.
Kaj so restrikcijski encimi?
Restrikcijski encim, pogosteje imenovan restrikcijska endonukleaza, ima sposobnost cepitve molekul DNK na majhne fragmente. Postopek cepitve poteka v bližini ali na posebnem prepoznavnem mestu molekule DNK, imenovanem restrikcijsko mesto. Prepoznavno mesto je običajno sestavljeno iz 4-8 baznih parov. Glede na mesto cepitve so lahko restrikcijski encimi štiri (04) različne vrste: tip I, tip II, tip III in tip IV. Razen mesta cepitve se pri diferenciaciji restrikcijskih encimov v štiri skupine upoštevajo dejavniki, kot so sestava, potreba po kofaktorjih in stanje tarčnega zaporedja.
Med cepitvijo molekul DNK je mesto cepitve lahko bodisi na samem restrikcijskem mestu bodisi oddaljeno od restrikcijskega mesta. Restrikcijski encimi ustvarijo dva zareza skozi vsako od sladkorno-fosfatnega ogrodja v dvojni vijačnici DNA.
Slika 02: Restrikcijski encimi
Restrikcijske encime najdemo predvsem v Achaea in bakterijah. Te encime uporabljajo kot obrambni mehanizem pred vdirajočimi virusi. Restrikcijski encimi cepijo tujo (patogeno) DNK, ne pa lastne DNK. Njihova lastna DNK je zaščitena z encimom, znanim kot metiltransferaza, ki spreminja DNK gostitelja in preprečuje cepitev.
Restrikcijski encim tipa I ima mesto cepitve, ki je oddaljeno od mesta prepoznavanja. Za delovanje encima sta potrebna ATP in protein S-adenozil-L-metionin. Restrikcijski encim tipa I velja za večnamenskega zaradi prisotnosti restrikcijskih in metilaznih aktivnosti. Restrikcijski encimi tipa II se cepijo znotraj samega prepoznavnega mesta ali na manjši razdalji od njega. Za svoje delovanje potrebuje samo magnezij (Mg). Restrikcijski encimi tipa II imajo samo eno funkcijo in so neodvisni od metilaze.
Kakšne so podobnosti med CRISPR in restrikcijskimi encimi?
- CRISPR in restrikcijski encimi so pomembna orodja pri spreminjanju genov.
- Del CRISPR ali Cas9 in restrikcijski encimi so endonukleaze.
- Oba lahko prepoznata značilna zaporedja DNK in cepita DNK.
- Prisotni so v bakterijah in arhejah.
- Tako CRISPR kot restrikcijski encimi so specifični za zaporedje.
Kakšna je razlika med CRISPR in restrikcijskimi encimi?
CRISPR-Cas sistem je prokariontski imunski sistem, ki zagotavlja odpornost na tuje genetske elemente. Po drugi strani pa so restrikcijski encimi endonukleaze, ki prepoznajo specifično zaporedje nukleotidov in povzročijo dvoverižni rez v DNK. To je torej ključna razlika med CRISPR in restrikcijskimi encimi.
Poleg tega CRISPR- omogoča izjemno natančne reze. V primerjavi s tem je cepitev z restrikcijskimi encimi manj natančna. Poleg tega je CRISPR napredna tehnika, medtem ko so restrikcijski encimi primitivni.
Spodnja infografika povzema razliko med CRISPR in restrikcijskimi encimi.
Povzetek – CRISPR proti restrikcijskim encimom
CRISPR in restrikcijski encimi sta dve vrsti tehnik, ki se uporabljata pri spreminjanju genov. CRISPR je prilagodljiva imunska zaščita, ki se izvaja v nekaterih bakterijah pred invazijo na osnovi tuje DNK. Je naravni obrambni mehanizem. Nasprotno pa so restrikcijski encimi endonukleaze, ki cepijo dvoverižno DNA. Tako CRISPR kot restrikcijski encimi lahko razrežejo DNK na majhne segmente. Vendar sta oba odvisna od zaporedja. V primerjavi s CRISPR so restrikcijski encimi primitivni. CRISPR omogoča izjemno natančne reze kot restrikcijski encimi. Torej, to je povzetek razlike med CRISPR in restrikcijskimi encimi.
