Ključna razlika – kromosomska hoja proti skakanju
Chromosome walking in chromosome jumping sta dve tehnični orodji, ki se uporabljata v molekularni biologiji za lociranje genov na kromosomih in fizično kartiranje genomov. Hoja po kromosomih je tehnika, ki se uporablja za kloniranje ciljnega gena v genomski knjižnici s ponavljajočo se izolacijo in kloniranjem sosednjih klonov genomske knjižnice. Kromosomsko preskakovanje je posebna različica kromosomske hoje, ki premaguje prelomne točke kromosomske hoje. Kromosomska hoja lahko sekvencira in preslika samo majhne dolžine kromosomov, medtem ko kromosomsko preskakovanje omogoča sekvenciranje velikih delov kromosomov. To je ključna razlika med kromosomsko hojo in kromosomskim skakanjem.
Kaj je hoja po kromosomih?
Chromosome walking je orodje, ki raziskuje neznane zaporedne regije kromosomov z uporabo prekrivajočih se restrikcijskih fragmentov. Pri hoji po kromosomih se del znanega gena uporabi kot sonda in nadaljuje s karakterizacijo celotne dolžine kromosoma, ki ga je treba preslikati ali sekvencirati. To poteka od markerja do ciljne dolžine. Pri hoji po kromosomih se konci vsakega prekrivajočega se fragmenta uporabijo za hibridizacijo za identifikacijo naslednjega zaporedja.
Sonde pripravimo iz končnih delov klonirane DNK in jih subkloniramo. Nato se uporabijo za iskanje naslednjega prekrivajočega se fragmenta. Vsa ta prekrivajoča se zaporedja se uporabljajo za izdelavo genetskega zemljevida kromosoma in lociranje ciljnih genov. Je metoda analiziranja dolgih odsekov DNK z majhnimi prekrivajočimi se fragmenti iz rekonstruirane genomske knjižnice.
Tehnika hoje po kromosomih – koraki
-
Izolacija fragmenta DNA, ki vsebuje znani gen ali marker v bližini ciljnega gena
- Priprava restrikcijske karte izbranega fragmenta in subkloniranje končne regije fragmenta za uporabo kot sonda
- Hibridizacija sonde z naslednjim prekrivajočim se fragmentom
- Priprava restrikcijskega zemljevida fragmenta 1 in subkloniranje končne regije fragmenta 1 za uporabo kot sonda za identifikacijo naslednjega prekrivajočega se fragmenta.
- Hibridizacija sonde z naslednjim prekrivajočim se fragmentom 2
- Priprava restrikcijske karte fragmenta 2 in subkloniranje končne regije fragmenta 2, ki služi kot sonda za identifikacijo naslednjega prekrivajočega se fragmenta
Zgornje korake je treba nadaljevati do ciljnega gena ali do 3' konca celotne dolžine zaporedja.
Slika 01: Tehnika hoje po kromosomih
Hoja po kromosomih je pomemben vidik citogenetike pri iskanju SNP številnih organizmov in analizi gensko prenosljivih bolezni ter odkrivanju mutacij ustreznih genov.
Kaj je kromosomsko preskakovanje?
Kromosomsko preskakovanje je tehnika, ki se uporablja v molekularni biologiji za fizično kartiranje genomov organizmov. Ta tehnika je bila uvedena, da bi premagali oviro kromosomske hoje, ki je nastala ob iskanju ponavljajočih se regij DNK med procesom kloniranja. Zato lahko tehniko kromosomskega preskoka obravnavamo kot posebno različico kromosomske hoje. Je hitra metoda v primerjavi s kromosomsko hojo in omogoča obhod ponavljajočih se sekvenc DNK, ki med kromosomsko hojo niso nagnjene k kloniranju. Kromosomsko preskakovanje zmanjša vrzel med ciljnim genom in razpoložljivimi znanimi markerji za preslikavo genoma.
Orodje za preskakovanje kromosomov se začne z rezanjem specifične DNK s posebnimi restrikcijskimi endonukleazami in ligacijo fragmentov v krožne zanke. Nato se za zaporedje krožnih zank uporabi primer, oblikovan iz znanega zaporedja. Ta primer omogoča skakanje in zaporedje na alternativni način. Tako lahko obide ponavljajoče se zaporedje DNK in se hitro sprehodi skozi kromosom za iskanje ciljnega gena.
Odkritje gena, ki kodira bolezen cistične fibroze, je bilo opravljeno z orodjem za kromosomske skoke. Skupaj lahko kromosomsko skakanje in hoja izboljšata proces preslikave genoma.
Slika 02: Kromosomsko preskakovanje
Kakšna je razlika med kromosomsko hojo in skakanjem?
Hoja po kromosomih proti skakanju |
|
| Kromosom je orodje, ki se uporablja v molekularni biologiji za preslikavo genoma in lociranje določenih genov. | Chromosome jumping je orodje, ki se uporablja za fizično preslikavo genomov in hitro iskanje ciljnih genov v kromosomih. |
| Primerjalne dolžine zaporedja | |
| Samo majhne fragmente je mogoče klonirati s kromosomsko hojo. | Večje dolžine kromosomov je mogoče preslikati s kromosomskim preskakovanjem. |
| Kloniranje ponavljajoče se DNK v kromosomih | |
| Tehnika hoje po kromosomih ima težave pri hoji skozi ponavljajoča se zaporedja DNK v kromosomih. | Omogoča obhod ponavljajočih se sekvenc DNK. Zato ni težav, ko jih najdemo med zaporedjem. |
| Dejavniki, ki vplivajo na procese | |
| Uspeh procesa je odvisen od velikosti genoma in razdalje, ki jo je treba "prehoditi" od znanega genomskega položaja do želenega gena. | Uspeh ni odvisen od velikosti genoma ali razdalje od markerja do tarče. |
| Učinki neklonirane DNK | |
| Kromosomsko hojo lahko ustavijo neklonirani fragmenti DNK. | Najnižja nota pikola, ki jo lahko zaigrate, je D4. |
| Potreba po znanem zaporedju | |
| Proces se začne z znanim genom blizu tarče. | Postopek zahteva znan fragment za oblikovanje primerja. |
Povzetek – kromosomska hoja proti skakanju
Hoja po kromosomih se pogosto uporablja, ko je znano, da se določen gen nahaja v bližini predhodno kloniranega gena v kromosomu in ga je mogoče identificirati s ponavljajočo se izolacijo sosednjih genomskih klonov iz genomske knjižnice. Ko pa med tehniko kromosomske hoje najdemo ponavljajoče se regije DNK, postopka ni mogoče nadaljevati. Zato se tehnika s te točke prekine. Kromosomsko preskakovanje je molekularno biološko orodje, ki premaga to omejitev za kartiranje genomov. Zaobide te ponavljajoče se regije DNK, ki jih je težko klonirati, in pomaga pri fizičnem kartiranju genomov. To je glavna razlika med kromosomsko hojo in skakanjem.
