Ključna razlika – RT PCR proti QPCR
Verižna reakcija s polimerazo je tehnika, ki se uporablja za pomnoževanje določene regije DNK in vitro. Zaradi izuma te tehnike, ki ga je leta 1983 izvedel Kary Mullis, lahko znanstveniki izdelajo od tisoč do milijonov kopij določenih fragmentov DNK za raziskovalne namene. Trenutno je postala običajna in rutinsko izvajana tehnika v kliničnih in raziskovalnih laboratorijih za široko paleto aplikacij. Obstajajo različice tradicionalne tehnike PCR, kot so RT PCR, ugnezdeni PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR itd. RT PCR in Q PCR sta dve pomembni različici PCR. Ključna razlika med RT PCR in Q PCR je v tem, da se RT PCR uporablja za odkrivanje izražanja genov z ustvarjanjem transkriptov komplementarne DNA (cDNA) iz RNA, medtem ko se Q PCR uporablja za kvantitativno merjenje produktov PCR v realnem času z uporabo fluorescentnih barvil.
Kaj je RT PCR?
Reverzna transkripcija polimerazne verižne reakcije (RT PCR) je različica PCR, ki se uporablja za odkrivanje ekspresije RNA. Je zelo pomembna metoda za odkrivanje izražanja mRNA v tkivih. RT PCR se uporablja, kadar je začetni material vzorca RNA. Pri RT PCR se vzorčna mRNA najprej pretvori v komplementarno DNA. Ta korak katalizira encim reverzna transkriptaza in proces je znan kot reverzna transkripcija. Drugič, tradicionalni PCR se uporablja za novo sintetizirano cDNA za pomnoževanje.
RT PCR je zelo občutljiva tehnika, ki zahteva relativno majhno količino vzorca RNK. RT PCR se pogosto uporablja pri diagnosticiranju in kvantifikaciji vrst RNA, zlasti virusov RNA, kot sta virus humane imunske pomanjkljivosti in virus hepatitisa C.
Slika 01: Tehnika RT PCR
Kaj je QPCR?
Kvantitativni PCR (QPCR) je različica PCR, ki se uporablja za kvantitativno merjenje produktov PCR. Imenuje se tudi verižna reakcija s polimerazo v realnem času, saj meri pomnoževanje v realnem času z uporabo naprave za PCR v realnem času. Je primerna metoda za določanje količine ciljnega zaporedja ali gena, prisotnega v vzorcu. Zanimiva lastnost QPCR je, da združuje pomnoževanje in pravo kvantifikacijo v enem koraku. Zato lahko potrebo po gelski elektroforezi pri detekciji odpravimo s tehniko QPCR. QPCR uporablja fluorescenčna barvila za označevanje produktov PCR med reakcijami PCR, ki na koncu vodijo do neposredne kvantifikacije. Ko se produkti PCR kopičijo, se kopičijo tudi fluorescenčni signali in to bo izmeril stroj v realnem času. QPCR se lahko kombinira z RT PCR. Znana je kot RT – QPCR ali QRT – PCR in velja za najmočnejšo, občutljivo in kvantitativno metodo za odkrivanje ravni RNA v celicah ali tkivih.
SYBR Green in Taqman sta dve metodi, ki se uporabljata za odkrivanje ali opazovanje procesa pomnoževanja PCR v realnem času. Metoda SYBR Green se izvaja z uporabo fluorescenčnega barvila, imenovanega SYBR green, in zazna pomnoževanje z vezavo barvila, da proizvede dvojno vijačno DNA. Taqman se izvaja z dvojno označenimi sondami in zazna pomnoževanje z razgradnjo sonde s polimerazo Taq in sprostitvijo fluoroforja, kot je prikazano na sliki 02. Obe metodi spremljata napredek procesa pomnoževanja in poročata o količini produkta v realnem času..
PCR v realnem času ima široko paleto aplikacij, kot so kvantifikacija genske ekspresije, analiza mikroRNA in nekodirane RNA, genotipizacija SNP, odkrivanje variant števila kopij, odkrivanje redkih mutacij, odkrivanje gensko spremenjenih organizmov, odkrivanje povzročiteljev okužb, itd.
Slika 02: Kvantitativna tehnika PCR
Kakšna je razlika med RT PCR in QPCR?
RT PCR proti QPCR |
|
| RT PCR je tehnika, ki se uporablja za odkrivanje izražanja genov s pomnoževanjem. | QPCR je tehnika, ki pomnoži DNK in kvantificira produkte PCR v realnem času. |
| Vpletenost encima reverzne transkriptaze | |
| Encimska reverzna transkriptaza se uporablja za RT PCR. | Encimska reverzna transkriptaza se ne uporablja za QPCR. |
| Uporaba fluorescentno označenih molekul | |
| Fluorescentno označena barvila ali sonde se ne uporabljajo za RT PCR. | Fluorescentno označena barvila ali sonde se uporabljajo za QPCR. |
| Kvantifikacija produkta PCR | |
| Razen če ni povezan s QPCR, RT PCR ne kvantificira produkta PCR. | QPCR kvantitativno izmerite produkt PCR. |
| Izhodni material | |
| Izhodni material je mRNA. | Izhodiščni material je DNK. |
| Sinteza cDNA | |
| Komplementarna DNK nastane med RT PCR. | Med QPCR ne nastane komplementarna DNK. |
Povzetek – RT PCR proti QPCR
RT PCR in QPCR sta dve različici tradicionalnega PCR. Tehnika RT PCR se izvaja za vzorce mRNA, poganja pa jo reverzna transkripcija in proizvodnja cDNA. QPCR se uporablja za kvantifikacijo produktov PCR med termičnimi cikli PCR v realnem času z uporabo fluorescentnih barvil ali označenih sond. Pri QPCR količino produkta PCR predstavljajo fluorescenčni signali, ki jih oddaja vzorec. RT PCR se pogosto uporablja kot postopek pomnoževanja, medtem ko se QPCR pogosto uporablja kot postopek kvantifikacije. To je razlika med RT PCR in QPCR.
