Ključna razlika – RAPD proti RFLP
Genetski markerji se uporabljajo v molekularni biologiji za prepoznavanje genetskih variacij med posamezniki in vrstami. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) in restrikcijski polimorfizem dolžine fragmenta (RFLP) sta dva pomembna molekularna označevalca, ki se redno uporabljata v laboratorijih. RAPD se izvaja s kratkimi in poljubnimi oligonukleotidnimi začetnimi začetnicami in temelji na naključnem pomnoževanju več lokacij v vzorčni DNK organizma. RFLP se izvaja s specifično restrikcijsko endonukleazo, temelji pa na polimorfizmu nastalih restrikcijskih fragmentov in hibridizaciji. Ključna razlika med RAPL in RFLP je, da je RAPD vrsta tehnike PCR, ki se izvaja brez predhodnega znanja o zaporedju, medtem ko RFLP ni vključen v PCR in zahteva predhodno znanje o zaporedju za izvedbo tehnike.
Kaj je RAPD?
RAPD je uporaben molekularni marker v molekularni biologiji. Je hitra in enostavna tehnika. RAPD lahko definiramo kot metodo, ki ima za posledico polimorfna zaporedja DNK kot rezultat naključnega pomnoževanja več lokacij ciljne predloge DNK. RAPD za pomnoževanje PCR uporablja kratke oligonukleotidne začetnike s poljubnimi sekvencami. Primerji so umetno sintetizirani brez predhodnega poznavanja zaporedja. Zato velja za enostavno in uporabno tehniko.
Naslednji glavni koraki so vključeni v RAPD.
- Izvleček ciljne DNK
- Pomnoževanje več lokacij tarčne DNK z uporabo naključno izbranih primerjev
- Gel elektroforeza pomnoženih produktov PCR
- Barvanje z etidijevim bromidom in identifikacija polimorfizma
Kot rezultat variacije pri žarjenju primerja se med pomnoževanjem ustvarijo različni fragmenti z različnimi dolžinami. Zato so trakovi na gelih različni med posamezniki in vrstami. Tako RAPD omogoča odkrivanje genetskih variacij med organizmi pri identifikaciji in diferenciaciji.
RAPD se uporablja v različnih študijah molekularne biologije, kot je identifikacija genetske razlike med sorodnimi vrstami, preslikava genov, odvzem prstnih odtisov DNK, identifikacija dednih bolezni itd.
Slika 01: RAPD
Kaj je RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) je molekularni marker, ki se uporablja v molekularni biologiji za identifikacijo genetske variacije v homolognih zaporedjih DNA. Je prvi genetski marker, razvit za odvzem prstnih odtisov DNK. Vsi organizmi proizvajajo edinstvene profile DNK, če so omejeni s posebnimi restrikcijskimi encimi. RFLP služi kot pomembno orodje pri izdelavi edinstvenih profilov DNK posameznikov in odkrivanju genetskih variacij med njimi. Ko vzorce DNK razgradimo s posebnimi restrikcijskimi endonukleazami, dobimo različne profile DNK, ki so edinstveni za vsakega posameznika. Zato je načelo te metode odkrivanje genetskih variacij med organizmi z omejevanjem homologne DNK s specifičnimi restrikcijskimi encimi in analizo polimorfizma dolžine fragmentov z gelsko elektroforezo in blotingom. Vzorci blotiranja so edinstveni za vsak organizem in označujejo specifične genotipe.
Naslednji koraki so povezani z RFLP.
- Izolacija zadostne količine DNK iz vzorcev
- Fragmentacija vzorcev DNK s specifičnimi restrikcijskimi endonukleazami v kratko zaporedje
- Ločevanje nastalih fragmentov različnih dolžin z elektroforezo v agaroznem gelu.
- Prenos profila gela v membrano s Southern blottingom
- Hibridizacija membrane z označenimi sondami in analiza polimorfizma dolžine fragmentov v vsakem profilu
RFLP ima različne aplikacije, kot so diagnosticiranje dednih bolezni, kartiranje genoma, kriminalistična identifikacija v forenzičnih študijah, testiranje očetovstva itd.
Slika 02: RFLP genotipizacija
Kakšna je razlika med RAPD in RFLP?
RAPD proti RFLP |
|
| RAPD je molekularni marker, ki temelji na naključnih primerjih in PCR. | RFLP je molekularni marker, ki temelji na produkciji različnih dolžinskih restrikcijskih fragmentov. |
| Zahtevan vzorec | |
| Majhni vzorci DNK zadostujejo za analizo RAPD. | Za analizo RFLP je potrebna velika količina ekstrahiranega vzorca DNK. |
| Ura | |
| RAPD je hiter postopek. | RFLP je dolgotrajen proces. |
| Uporaba temeljnega premaza | |
| Uporabljajo se naključni primerji in isti primerji se lahko uporabljajo za različne vrste. | V RFLP se za hibridizacijo uporabljajo specifične sonde za vrsto. |
| Zanesljivost | |
| Zanesljivost tehnike je manjša v primerjavi z RFLP. | RFLP je zanesljiva tehnika. |
| Blotting | |
| RAPD vključuje južni bloting. | Southern blotting je en korak RFLP. |
| Odkrivanje alelne variacije | |
| Alelnih variacij ni mogoče zaznati z RAPD. | Alelne variacije lahko zazna RFLP. |
| Potreba po znanju zaporedja | |
| RAPD ne zahteva predhodnega znanja o zaporedju. | Za načrtovanje sonde je potrebno predhodno znanje zaporedja. |
| PCR | |
| PCR je povezan z RAPD | PCR ni povezan z RFLP. |
| Ponovljivost | |
| RAPD ima nizko ponovljivost | RFLP ima visoko ponovljivost v primerjavi z RAPD. |
Povzetek – RAPD proti RFLP
RAPD in RFLP sta pomembna označevalca, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Obe metodi sta sposobni zaznati genetske variacije med organizmi. RAPD se izvaja z uporabo naključnih primerjev. RFLP se izvaja z uporabo posebnih restrikcijskih encimov. Obe metodi proizvajata profile DNK, edinstvene za posamezne organizme. RAPD vključuje primerljivo malo korakov kot RFLP. Vendar daje manj zanesljive in ponovljive rezultate kot RFLP. To je glavna razlika med RAPD in RFLP.
