Ključna razlika – AFLP proti RFLP
Študije DNK imajo izjemen pomen pri razumevanju in določanju filogenetskih odnosov, diagnosticiranju genetskih bolezni in kartiranju genomov organizmov. Več tehnik, povezanih z analizo DNK, se uporablja tudi za identifikacijo določenega gena ali zaporedja DNK v skupini neznane DNK. Znani so kot molekularni markerji. Pomnoženi polimorfizem dolžine fragmenta (AFLP) in polimorfizem dolžine restrikcijskega fragmenta (RFLP) sta dva taka molekularna markerja (metodi), razvita v molekularni biologiji za odkrivanje genetskih variacij med organizmi. Obe metodi sta enako pomembni ter imata prednosti in slabosti. Ključna razlika med AFLP in RFLP je, da AFLP vključuje selektivno PCR pomnoževanje prebavljene DNA, medtem ko RFLP ne vključuje selektivnega PCR pomnoževanja fragmentov DNA.
Kaj je AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) je pomembno orodje v molekularni biologiji in se v veliki meri uporablja pri analizi genetske variacije. AFLP temelji na specifičnem PCR pomnoževanju fragmentirane genomske DNA in detekciji polimorfizma z avtoradiografi z gelsko elektroforezo. AFLP veliko prispeva k prepoznavanju genetskih razlik v sevih ali tesno povezanih vrstah različnih kraljestev, vključno z rastlinami, živalmi, bakterijami in glivami. AFLP je mogoče izvesti z majhnimi količinami neznanih vzorcev DNK. Ne zahteva predhodnega znanja o zaporedju in oblikovanja sond.
Koraki AFLP
- Izolacija DNK
- Prebava DNK z restrikcijskimi endonukleazami
- Ligacija omejenih fragmentov DNK z adapterji
- Selektivna amplifikacija fragmentov s posebnimi restrikcijskimi mesti
- Ločevanje produktov PCR z gelsko elektroforezo
- Vizualizacija matrice gela z avtoradiografom
AFLP je bolj občutljiva in ponovljiva metoda, ki jo je mogoče uporabiti pri profiliranju DNK več taksonov, vključno z glivami, bakterijami, rastlinami in živalmi, brez predhodnega poznavanja zaporedij DNK. Pomaga pri prepoznavanju manjših razlik med posamezniki v populaciji zaradi svoje zelo občutljive narave. AFLP je pomemben tudi pri kartiranju genoma, forenzičnih študijah, testiranju staršev, genotipizaciji itd.
Slika 01: AFLP
Kaj je RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) je tehnika, ki se uporablja za odkrivanje genetskih variacij v homolognih zaporedjih DNK. To je prva metoda, razvita za profiliranje DNK. Organizmi imajo edinstvene DNK prstne odtise ali DNK profile. RFLP služi kot pomembno orodje za analizo variacije med profili DNK intraspecifičnih ali tesno povezanih organizmov, saj imajo homologna zaporedja različna restrikcijska mesta (lokacije), ki so edinstvene za določen organizem. Ko se homologna DNK razgradi s posebnimi restrikcijskimi endonukleazami, bo to povzročilo različne profile DNK, ki so edinstveni za vsakega posameznika. Zato je načelo te metode odkrivanje genetskih variacij med organizmi z omejevanjem homologne DNK s specifičnimi restrikcijskimi encimi in analizo polimorfizma dolžine fragmentov z gelsko elektroforezo in blotingom. Vzorci blotiranja so edinstveni za vsak organizem in označujejo specifične genotipe.
Koraki RFLP
- Izolacija zadostne količine DNK iz vzorcev
- Fragmentacija vzorcev DNK s specifičnimi restrikcijskimi endonukleazami v kratko zaporedje
- Ločevanje nastalih fragmentov različnih dolžin z elektroforezo v agaroznem gelu.
- Prenos profila gela v membrano s Southern blottingom
- Hibridizacija membrane z označenimi sondami in analiza polimorfizma dolžine fragmentov v vsakem profilu
RFLP je zelo pomembna tehnika pri odkrivanju dednosti bolezni in ugotavljanju tveganja za pojav bolezni med družinskimi člani. RFLP se pogosto uporablja tudi pri kartiranju genoma, identifikaciji kriminalcev v forenziki, testiranju očetovstva itd. RFLP ima tudi več omejitev. RFLP zahteva predhodno poznavanje podatkov o zaporedju za načrtovanje sond za hibridizacijo. Prav tako zahteva izolacijo zadostne količine DNK iz vzorca za analizo, kar je v forenzičnih študijah težko.
Slika 01: Preslikava RRFLP
Kakšna je razlika med AFLP in RFLP?
ALFP proti RFLP |
|
| AFLP vključuje selektivno PCR pomnoževanje prebavljene DNA. | RFLP ne vključuje PCR, razen če je PCR-RFLP. |
| Znanje zaporedja | |
| Predhodno znanje zaporedja ni potrebno. | Za oblikovane RFLP sonde je potrebno predhodno znanje o zaporedju. |
| Zanesljivost | |
| To je bolj zanesljivo. | To je manj zanesljivo v primerjavi z AFLP. |
| Učinkovitost pri odkrivanju polimorfizma | |
| To ima večjo učinkovitost pri odkrivanju polimorfizma kot RFLP. | To je manj učinkovito v primerjavi z AFLP. |
| Cena | |
| To je malo drago v primerjavi z RFLP. | To je ceneje v primerjavi z AFLP. |
| Aplikacije | |
| AFLP so bili uporabljeni za kartiranje genoma, prstne odtise DNK, študije genetske raznolikosti, testiranje očetovstva in forenziko | Analiza RFLP je pomembno orodje pri kartiranju genoma, lokalizaciji genov za genetske motnje, določanju tveganja za bolezni in testiranju očetovstva. |
Povzetek – AFLP proti RFLP
AFLP in RFLP sta dve tehniki, ki se uporabljata kot genetski označevalci za vrednotenje raznolikosti in oceno genetskih odnosov v molekularni biologiji. AFLP služi kot učinkovita in občutljiva metoda za odkrivanje genetskega polimorfizma med organizmi kot RFLP. Čeprav imata obe metodi različno učinkovitost pri odkrivanju genetskih variacij, se še vedno uporabljata za odvzem prstnih odtisov DNK in diagnozo bolezni.
