Ključna razlika – Nick Translation proti Primer Extension
Prevajanje Nicka in razširitev primerja sta dve pomembni tehniki, ki se izvajata v molekularni biologiji. Ključna razlika med prevajanjem nicka in podaljškom primerja je v tem, da postopek prevajanja nicka proizvaja označene sonde za druge tehnike hibridizacije, medtem ko metoda podaljševanja primerja identificira specifično zaporedje RNA iz mešanice in razkrije informacije o izražanju mRNA. Obe tehniki sta zelo pomembni in se redno izvajata v laboratorijih za molekularne raziskave.
Kaj je Nick Translation?
Prevajanje Nicka je pomembna tehnika, ki se uporablja za pripravo označenih sond za različne molekularno biološke tehnike, kot so blotiranje, in situ hibridizacija, fluorescentna in situ hibridizacija itd. Gre za in vitro metodo označevanja DNK. DNA sonde se uporabljajo za identifikacijo specifičnih zaporedij DNA ali RNA. S pomočjo označene sonde je mogoče iz kompleksne mešanice nukleinske kisline označiti ali vizualizirati specifične fragmente. Zato so označene sonde pripravljene z uporabo različnih tehnik, ki se uporabljajo za različne tehnike. Prevajanje Nicka je ena takšnih metod, ki proizvaja označene sonde s pomočjo encimov DNaza 1 in DNK polimeraza 1.
Proces prevajanja vzdevkov se začne z aktivnostjo encima DNase 1. DNaza 1 uvaja zareze v fosfatno ogrodje dvoverižne DNK s cepitvijo fosfodiestrskih vezi med nukleotidi. Ko je nick ustvarjen, se bo sprostila prosta 3' OH skupina nukleotida in nanjo bo deloval encim DNA polimeraza 1. 5' do 3' eksonukleazna aktivnost DNA polimeraze 1 odstrani nukleotide iz zareza v smeri 3' verige DNA. Hkrati deluje polimerazna aktivnost encima DNA polimeraza 1 in dodaja nukleotide, ki nadomestijo odstranjene nukleotide. Če so bili nukleotidi označeni, bo prišlo do zamenjave z označenimi nukleotidi in bo označilo DNK za identifikacijo. To novo sintetizirano označeno DNK je mogoče uporabiti kot sonde v različnih reakcijah hibridizacije v molekularni biologiji.
Slika 01: Postopek prevajanja vzdevka
Kaj je Primer Extension?
Razširitev primerja je tehnika, ki se uporablja za iskanje specifičnega zaporedja RNA iz mešanice RNA in lociranje 5' konca zapisa mRNA. Uporablja se tudi za preučevanje strukture RNA in izražanja. Metoda razširitve primerjev se izvaja z označenimi primerji ali z označenimi nukleotidi. Če se uporabljajo označeni primerji, to izključuje potrebo po označevanju nukleotidov, ki se uporabljajo za sintezo cDNA. V tej tehniki je več korakov. Začne se z ekstrakcijo RNK iz vzorca. Nato se mešanici doda označeni oligonukleotidni primer skupaj s potrebnimi sestavinami za sintezo cDNA specifičnega zaporedja RNA. Primer se žari s komplementarnim zaporedjem iz mešanice. Z uporabo žarjenega zaporedja primerja kot matrice encim reverzna transkriptaza sintetizira komplementarno DNA (cDNA) zaporedja RNA. Žarjenje primerja in reverzna transkripcija se pojavita le, če je v vzorcu prisotno specifično zaporedje RNA. Ko se izvaja elektroforeza z denaturirajočim gelom, je mogoče določiti velikost zaporedja RNA. Prav tako je enostavno najti bazo +1 zaporedja mRNA (mesto iniciacije transkripcije) z metodo razširitve primerja. Količino mRNA, ki je prisotna v vzorcu, je mogoče kvantificirati s to metodo, če uporabimo presežek primerja.
Slika 02: Podaljšek primerja
Kakšna je razlika med Nick Translation in Primer Extension?
Nick Translation proti Primer Extension |
|
| Prevajanje Nicka je proces, ki ustvari označene sonde DNK za različne hibridizacijske reakcije. | Razširitev primerja je tehnika, ki se uporablja za iskanje specifične RNA ali za preučevanje izražanja genov. |
| Uporabljeni encimi | |
| Uporabljajo se encimi DNaza 1 in DNA polimeraza. | Uporablja se encim reverzne transkriptaze. |
| Pomembnost | |
| Prevajanje Nicka olajša označevanje določenega zaporedja DNK. | Razširitev primerja omogoča zaznavanje specifične velikosti zaporedja mRNA in količine, prisotne v vzorcu. |
Povzetek – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation je metoda, ki se uporablja za sintezo označenih sond na podlagi aktivnosti encimov DNaze 1 in E coli DNA polimeraze 1. To je metoda in vitro, ki se uporablja v laboratorijih pred različnimi tehnikami hibridizacije. Med prevajanjem zareza 5’-3’ eksonukleazna aktivnost DNA polimeraze 1 odstrani nukleotide pred zarezo, polimerazna aktivnost DNA polimeraze 1 pa zamenja odstranjene nukleotide z označenimi nukleotidi za zarezo. Razširitev primerja je metoda, ki se uporablja za odkrivanje specifičnega transkripta RNA iz mešanice in kvantificiranje velikosti in količine zanimive RNA. To je razlika med prevodom vzdevka in razširitvijo primerja.
