Ključna razlika med Golden Gate in Gibson Assembly je, da se Golden Gate opira na prisotnost restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati, medtem ko se Gibson Assembly ne zanaša na prisotnost restrikcijskih mest znotraj določenega zaporedja biti kloniran.
V zadnjih desetletjih so molekularni znanstveniki razvili različne standardizirane postopke, ki omogočajo lažje sestavljanje več fragmentov DNK v en kos. Zato raziskovalci v znanstvenih poskusih pogosto uporabljajo metode kloniranja, kot so restrikcijska encimska ligacija, prehodno kloniranje, Gibsonova montaža, Golden Gate montaža in TOPO kloniranje. Zato sta Golden Gate in Gibson Assembly dve metodi molekularnega kloniranja, ki omogočata sestavljanje več fragmentov DNK v en kos.
Kaj je skupščina Golden Gate?
Golden Gate je metoda molekularnega kloniranja, ki olajša sestavljanje več fragmentov DNK v en kos. Ta metoda temelji na prisotnosti restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati. Izvira iz leta 1996. Ta tehnika uporablja restrikcijske encime tipa IIS in T4 DNA ligazo. Ti encimi režejo DNK zunaj prepoznavnih mest. Ustvarijo lahko nepalindromske previse. Zato je mogoče z uporabo kombinacij previsnih zaporedij sestaviti več fragmentov DNK.
Slika 01: Golden Gate
Postopek montaže Golden Gate
Tehnika Golden Gate ima glavne tri korake v svojem postopku:
- ustvarjanje previsov v vektorju za kloniranje,
- sestavljanje več vstavkov DNK z uporabo zaporedij, specifičnih za fragmente v previsih, in
- ligacija.
Sklop Golden Gate uporablja krožne vektorje za kloniranje (ciljni vektor). Poleg tega se pri tej metodi restrikcijsko mesto odstrani iz ligiranega produkta, da se istočasno izvede razgradnja in ligacija. Tipičen protokol termičnega cikla za Golden Gate niha med 37 °C in 16 °C, ker je 37 °C optimalno za restrikcijske encime, 16 °C pa za ligaze.
Kaj je Gibson Assembly?
Gibson Assembly je metoda molekularnega kloniranja, ki omogoča sestavljanje več fragmentov DNK v en kos. Za razliko od metode Golden Gate se ta metoda ne zanaša na prisotnost restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati. Ugotovil ga je Daniel G. Gibson z inštituta J. Craig Venter. Ta tehnika je vrsta metode kloniranja, neodvisnega od zaporedja in ligaze (SLIC).
Slika 02: Gibsonov sklop
Postopek sestavljanja Gibson
Gibson Assembly potrebuje fragmente DNK, ki vsebujejo 20-40 baznih parov, ki se prekrivajo s sosednjimi fragmenti DNK. Prekrivanja se dodajo s PCR. Nato se ti fragmenti DNK dodajo mešanici Gibson maser, ki ima tri encime. Ta postopek se izvede v izotermičnih pogojih (50 °C za 1 uro) z uporabo treh različnih encimov: eksonukleaze, DNA polimeraze in DNA ligaze. Eksonukleaza prežveči DNK s 5' konca. Tako ne zavira aktivnosti polimeraze in omogoča, da reakcija poteka v enem samem procesu. Nastale enoverižne regije na sosednjih fragmentih DNA se lahko žarijo zaradi prekrivanja zaporedij. DNA polimeraza zapolni vrzeli z dodajanjem nukleotidov. Končno se DNA ligaza kovalentno poveže z DNA sosednjih segmentov. Običajno Gibson Assembly uporablja linearizirane ciljne vektorje. Poleg tega lahko ta metoda hkrati združi do 15 fragmentov DNK na podlagi podobnosti zaporedja.
Podobnosti med Golden Gateom in Gibsonovim sklopom
- Golden Gate in Gibson Assembly sta dve metodi molekularnega kloniranja.
- Obe metodi lahko sestavita več fragmentov DNK v en kos.
- Te metode uporabljajo ciljne vektorje.
- Obe metodi uporabljata termične ciklerje za sestavljanje več fragmentov DNK.
- Uporabljajo se pri mutagenezi, usmerjeni na mesto.
Razlika med Golden Gate in Gibson sklopom
Golden Gate je metoda molekularnega kloniranja, ki se uporablja pri sestavljanju več fragmentov DNK v en kos, ki temelji na prisotnosti restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati, medtem ko je Gibson Assembly metoda molekularnega kloniranja, ki se uporablja v sestavljanje več fragmentov DNK v en sam kos brez zanašanja na prisotnost restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati. To je ključna razlika med Golden Gate in Gibson Assembly. Poleg tega metoda Golden Gate uporablja krožni ciljni vektor, medtem ko Gibsonova skupna metoda uporablja lineariziran ciljni vektor.
Naslednja infografika prikazuje razlike med Golden Gate in Gibson Assembly.
Povzetek – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekularno kloniranje je metoda, ki se uporablja za sestavljanje rekombinantnih molekul DNA in usmerjanje njihove replikacije v gostiteljskih organizmih. Golden Gate in Gibson Assembly sta dve metodi molekularnega kloniranja, ki omogočata sestavljanje več fragmentov DNK v en kos. Metoda Golden Gate temelji na prisotnosti restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati, medtem ko Gibson Assembly ne temelji na prisotnosti restrikcijskih mest v določenem zaporedju, ki ga je treba klonirati. To je torej ključna razlika med Golden Gate in Gibson Assembly.
