Ključna razlika – povezovanje s topim in lepljivim koncem
Restrikcijske endonukleaze so specifični encimi, ki režejo dvoverižno DNA (dsDNA). V molekularni biologiji so znani tudi kot molekularne škarje. Restrikcijski encimi lahko prepoznajo specifična kratka zaporedja dsDNA, znana kot prepoznavna mesta, in cepijo fosfodiesterske in vodikove vezi, da odprejo dvojne verige. Kot posledica cepitve s temi encimi nastanejo fragmenti DNK z različnimi vrstami koncev, kot so lepljivi in topi konci. DNK ligaza je encim, ki se uporablja v molekularni biologiji za združevanje dveh sosednjih verig DNK z oblikovanjem novih vezi. Korak je znan kot ligacija in glede na vrsto vezanega konca DNK jih lahko imenujemo ligacija s topim koncem in ligacija z lepljivim koncem. Ključna razlika med ligacijo s topim in lepljivim koncem je v tem, da se ligacija s topim koncem pojavi med fragmenti DNA, ki vsebujejo dva topa konca, medtem ko se ligacija z lepljivim koncem pojavi med 5' in 3' previsi. V primerjavi z ligacijo s topim koncem je ligacija s topim koncem bolj učinkovita in stabilna.
Kaj je ligacija s topim koncem?
Nekatere restrikcijske endonukleaze lahko prerežejo DNK na nasprotnih bazah in proizvedejo fragmente DNK s topimi konci. Ti encimi so znani kot rezila s topimi konci; cepijo se naravnost navzdol do sredine restrikcijskega mesta, ne da bi zapustili enoverižne previsne baze. Topi konci so znani tudi kot ne-previsni konci, ker nimajo 3' in 5' previsnih baz na koncih. Oba pramena se zaključita z baznimi pari na topih koncih. Pogosti encimi za rezanje s topim koncem so EcoRV HaeIII, AluI in SmaI.
Ligacija topega konca je vključena med dvema topima koncema. Ne gre za ligacijo štrlečih baz. Ta ligacija je manj učinkovita kot ligacija lepljivega konca. Vendar pa v nekaterih primerih ligacija s topim koncem postane ugodnejša od ligacije z lepljivim koncem, zlasti pri ligaciji produktov PCR. Produkti PCR so vedno proizvedeni s topimi konci. Ligacija s topim koncem ne zahteva komplementarnih koncev v DNK za ligacijo.
Slika 01: Proizvodnja topega konca z encimom Eco RV
Kaj je ligacija lepljivega konca?
Nekatere restrikcijske endonukleaze lahko prerežejo dsDNA in na koncu pustijo previsen kos enoverižne DNA. Ti konci so znani kot lepljivi ali previsni konci. Do povezovanja lepljivih koncev pride med dvema fragmentoma DNA, ki vsebujeta ujemajoče se previse, ker imajo lepljivi konci neparne baze in potrebujejo komplementarne baze za tvorbo vezi. Zato je treba uporabiti isti restrikcijski encim za oba vira DNA, da proizvedemo ujemajoče se ligacijske fragmente.
Ligacija lepljivih koncev je učinkovitejša in pogosto zelo zaželena v procesih kloniranja. Obstaja več restrikcijskih encimov, ki proizvajajo lepljive konce. To so EcoRI, BamHI, HindIII itd.
Slika 02: Proizvodnja lepljivega konca z encimom Eco RI
Kakšna je razlika med ligacijo s topim in lepljivim koncem?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Ligacija na topih koncih se zgodi med dvema fragmentoma DNK s topimi konci. | Ligacija lepljivih koncev se pojavi med dvema ujemajočima se fragmentoma DNK z lepljivimi konci. |
| Encimi | |
| Rezila s topimi konci dajejo tope konce. | Rezila za lepljive konce ustvarijo lepljive ali kohezivne konce. |
| Zahteva za ujemanje koncev | |
| Ne zahteva ujemajočih se fragmentov ali komplementarnih baz. | Potrebne so komplementarne baze na koncih, da tvorijo bazne pare. |
| Učinkovitost | |
| Je manj učinkovito kot ligacija lepljivega konca | Učinkovitejše je kot ligacija s topim koncem. |
Povzetek – Blunt vs Sticky End Ligation
Restrikcijske endonukleaze lahko cepijo dsDNA in proizvedejo fragmente DNA z različnimi konci. Prepoznajo specifične sekvence in omejujejo DNK, ki ustvarja lepljive in tope konce. Lepljivi konci imajo na koncu fragmentov neparne baze. Topi konci nastanejo zaradi ravnega dekolteja in imajo na koncih bazne pare. Vezanje lepljivega konca zahteva dva komplementarna kosa enoverižne DNK. Topa ligacija se pojavi med katerima koli dvema topima končnima fragmentoma. To je razlika med topim in lepljivim ligiranjem.
