Ključna razlika – papir v primerjavi s tankoplastno ali kolonsko kromatografijo
Papirna kromatografija, tankoplastna kromatografija in kolonska kromatografija so tri vrste kromatografskih tehnik. Ključna razlika med papirno kromatografijo, tankoplastno kromatografijo in kolonsko kromatografijo temelji na vrsti stacionarne faze, ki se uporablja v kromatografski tehniki. Papirna kromatografija uporablja celulozni papir kot svojo stacionarno fazo, tankoplastna kromatografija uporablja aluminijev oksid ali silikagel kot svojo stacionarno fazo, medtem ko kolonska kromatografija uporablja kolono, napolnjeno z ustreznim matričnim materialom, kot svojo stacionarno fazo.
V procesu ločevanja in identifikacije biomolekul, kot so beljakovine in ogljikovi hidrati, je kromatografija pomembna uporabljena biofizikalna tehnika. Kromatografija loči spojine glede na njihovo topnost, velikost in naboj. Na podlagi mehanizma ločevanja kromatografija uporablja mehanizme, kot so ionska izmenjava, absorpcija, porazdelitev in izključitev velikosti, obstajajo pa tri kromatografske tehnike; in sicer papirna, tankoplastna in kolonska kromatografija. Papirna kromatografija temelji na adsorpciji trdno-tekoče in topnosti spojine ter uporablja celulozni papir kot stacionarno fazo. Tankoplastna kromatografija temelji na adsorpciji molekul trdno-tekoče. Ima stacionarno fazo, ki je običajno narejena iz aluminijevega oksida ali silikagela, in mobilno fazo, ki je topilo. Kolonska kromatografija uporablja kolono, napolnjeno z matriko, ki se uporablja za ločevanje molekul predvsem na podlagi njihove velikosti, afinitete ali naboja.
Kaj je papirna kromatografija?
Papirna kromatografija je najpreprostejša uporabljena vrsta kromatografije in se ne uporablja za obsežne raziskave. Uporablja se predvsem v študentskih laboratorijih za identifikacijo biomolekul, kot so aminokisline in ogljikovi hidrati, prisotni v mešanicah. Papirna kromatografija uporablja stacionarno fazo, ki je narejena s celuloznim papirjem ali filtrirnim papirjem Whatman, in mobilno fazo, ki je običajno pripravljena z uporabo organskih topil, kot je n-butanol itd. Stacionarna faza je nasičena z vodo, zaradi česar je stacionarna faza tekoča. Ko torej spojine opazimo in pustimo teči v prisotnosti mobilne faze, se ločijo, odvisno od topnosti spojin. Tako lahko po razvoju kromatograma izvedemo barvanje, da določimo dolžino serije vsake spojine. Tako je mogoče izračunati faktor zadrževanja.
Slika 01: Papirna kromatografija
Papirno kromatografijo lahko nadalje razvrstimo kot naraščajočo papirno kromatografijo in padajočo papirno kromatografijo, odvisno od smeri tekočega topila.
Kaj je tankoplastna kromatografija?
Tankoplastna kromatografija ali TLC je pogosto uporabljena tehnika za identifikacijo različnih aminokislin, prisotnih v mešanici, ali za identifikacijo beljakovin. Tehnika ločevanja temelji na adsorpciji trdno-tekoče. Pri tankoplastni kromatografiji se kot stacionarna faza uporablja plošča iz aluminijevega oksida ali silikagela. Mešanica topil se razlikuje glede na zahteve in lahko za pripravo topila uporablja različne kombinacije organskih spojin, kot so n-butanol, ocetna kislina in voda. Spojine, ki jih je treba ločiti, se nanesejo na ploščo in potopijo v mešanico topil. Ko topilo potuje navzgor na podlagi kapilarnega delovanja plošče, se spojine, opažene na plošči, premaknejo tudi glede na njihovo topnost v topilu.
Slika 02: Tankoplastna kromatografija
Detekcija madežev po kromatogramu poteka z različnimi postopki barvanja. Nekateri uporabljajo barvanje z ninhidrinom, ki je dokaj strupena metoda barvanja. Sodobni tankoplastni kromatogrami uporabljajo fluorescenčne tehnike za ogled kromatograma po preskusu. Glede na razdalje, ki jih je prepotovala, je mogoče izračunati retencijski čas vsake spojine. To se lahko uporabi za identifikacijo vrste spojine, ločene na podlagi uporabljene zmesi. TLC se v glavnem uporablja za identifikacijo aminokislin v mešanici beljakovin in tudi za ločevanje različnih vrst monosaharidov, prisotnih v mešanici.
Kaj je kolonska kromatografija?
Kolonska kromatografija je širok izraz, ki se uporablja za opis številnih vrst kromatografskih tehnik, ki uporabljajo metodo ločevanja na podlagi kolone. Pri kolonski kromatografiji se uporablja fizična kolona s polnilnim materialom za ločevanje spojin. Ločitev lahko temelji na različnih fizikalnih lastnostih, ki jih kažejo spojine. Te lastnosti so lahko naboj, velikost, 3D konformacija in sposobnost vezave itd. Tako kolona, napolnjena z matričnim materialom, deluje kot stacionarna faza, pralni pufer, ki se nanese na kolono, pa deluje kot mobilna faza.
Če so molekule ločene glede na velikost, je embalažni material zapakiran na način, da pušča pore, skozi katere potujejo spojine. Tako se najprej eluirajo večje molekule, ki ne morejo teči skozi pore, medtem ko manjše molekule potrebujejo veliko več časa za eluiranje.
Slika 03: Kolonska kromatografija
Če so molekule ločene glede na njihov naboj, bo stacionarna faza vsebovala anionski ali kationski izmenjevalec, ki bo spojine pritegnil glede na njihov naboj. Tako bodo med korakom pranja nevezane spojine eluirane. Po dodajanju elucijskega pufra se bodo vezane nabite spojine eluirale. Zaznavanje teh eluentov večinoma temelji na spektrofotometričnih tehnikah.
Kakšne so podobnosti med papirnato tankoplastno in kolonsko kromatografijo?
- Vse tri tehnike papirnate tankoplastne in kolonske kromatografije se uporabljajo za ločevanje biomolekul, kot so aminokisline, beljakovine in ogljikovi hidrati.
- Tehnike papirnate tankoplastne in kolonske kromatografije imajo mobilno fazo in stacionarno fazo.
- Tehnike papirnate tankoplastne in kolonske kromatografije uporabljajo biofizične mehanizme za ločevanje.
Kakšna je razlika med papirnato tankoplastno in kolonsko kromatografijo?
Papir proti tankoplastni proti kolonski kromatografiji |
|
| Papirna kromatografija | Papirna kromatografija je kromatografska tehnika, ki se uporablja za ločevanje spojin na podlagi adsorpcije tekočina-tekočina in topnosti spojine. Kot stacionarno fazo uporablja celulozni papir. |
| tankoplastna kromatografija | Tankoplastna kromatografija je še ena kromatografska tehnika, ki temelji na adsorpciji molekul na trdno in tekoče. Ima stacionarno fazo iz aluminijevega oksida ali silikagela in topilo kot mobilno fazo, ki je topilo. |
| Kolonska kromatografija | Kolonska kromatografija uporablja kolono, napolnjeno z matriko, ki se uporablja za ločevanje molekul predvsem na podlagi njihove velikosti, afinitete ali naboja. |
| Stacionarna faza | |
| Papirna kromatografija | Papir iz nitroceluloze Whatman se uporablja kot stacionarna faza v papirni kromatografiji. |
| tankoplastna kromatografija | Aluminijev oksid ali silikagel se uporablja kot stacionarna faza tankoplastne kromatografije. |
| Kolonska kromatografija | Kolona, napolnjena z ustreznim polnilnim materialom, se uporablja kot stacionarna faza v kolonski kromatografiji. |
| Mobilna faza | |
| Papirna kromatografija | Tekoče topilo je mobilna faza papirne kromatografije. |
| tankoplastna kromatografija | Tekoče topilo je mobilna faza tankoplastne kromatografije. |
| Kolonska kromatografija | Piralni pufer je mobilna faza kolonske kromatografije. |
| Mehanizmi, ki se uporabljajo za ločevanje | |
| Papirna kromatografija | Papirna kromatografija temelji na absorpciji trdno-tekoče. |
| tankoplastna kromatografija | Tankoplastna kromatografija temelji na absorpciji trdno-tekoče. |
| Kolonska kromatografija | Kolonska kromatografija temelji na izključitvi velikosti, naboju in obliki. |
| Elucijski pufer | |
| Papirna kromatografija | Ni potrebno za papirno kromatografijo. |
| tankoplastna kromatografija | Ni potrebno za tankoplastno kromatografijo. |
| Kolonska kromatografija | Potrebno pri kolonski kromatografiji. |
| Zaznavanje | |
| Papirna kromatografija | Barvanje in z določanjem retencijskega faktorja. |
| tankoplastna kromatografija | Barvanje in z določanjem retencijskega faktorja. |
| Kolonska kromatografija | Spektrofotometrična določitev. |
Povzetek – tankoplastna kromatografija v primerjavi s kolonsko kromatografijo
Papirna kromatografija, TLC in kolonska kromatografija so tehnike ločevanja, ki se uporabljajo za ločevanje biomolekul, kot so beljakovine, aminokisline in ogljikovi hidrati (predvsem monosaharidi). Papirna kromatografija uporablja celulozni papir kot stacionarno fazo, mehanizem ločevanja pa temelji na adsorpciji trdno-tekoče. TLC uporablja tudi mehanizme adsorpcije trdno-tekoče. Molekule se ločijo na stacionarni fazi, odvisno od njihove topnosti v mobilni fazi. Kolonska kromatografija za ločevanje uporablja fizikalne lastnosti, kot so velikost, oblika, naboj in molekulska masa spojine. Kolona, napolnjena z matričnim materialom, deluje kot stacionarna faza, medtem ko pralni pufer deluje kot faza topila. To je razlika med tankoplastno papirno kromatografijo in kolonsko kromatografijo.
