Ključna razlika med kromatofokusiranjem in izoelektričnim fokusiranjem je, da je kromatofokusiranje vrsta metode kolonske kromatografije, ki uporablja ionske izmenjevalne smole, medtem ko je izoelektrično fokusiranje vrsta tehnike elektroforeze, ki uporablja imobilizirane gele z gradientom pH.
Kromatofokusiranje in izoelektrično fokusiranje sta dve tehniki, ki ločujeta proteine glede na njihove izoelektrične točke. Tako kromatofokusiranje kot izoelektrično fokusiranje imata veliko moč ločljivosti. Kromatofokusiranje je metoda kolonske kromatografije visoke ločljivosti, medtem ko je izoelektrično fokusiranje metoda elektroforetskega ločevanja. Poleg tega kromatofokusiranje ne uporablja električnega polja, medtem ko izoelektrično fokusiranje potrebuje električno polje.
Kaj je kromatofokusiranje?
Kromatofokusiranje je vrsta kromatografije z visoko elucijo, ki ločuje proteine glede na razlike v njihovi izoelektrični točki. Uporablja kolono z ionsko izmenjevalno smolo in notranje razvit gradient pH. Za razliko od izoelektričnega fokusiranja kromatofokusiranje ne vključuje električnega polja. Kromatofokusiranje je močna tehnika čiščenja, ki lahko loči zelo podobne molekule, ki se razlikujejo le za 0,02 pH enote. Zato je kromatofokusiranje najprimernejše kot končni korak poliranja, ko je potrebna visoka ločljivost pri ločevanju zelo podobnih komponent.
Pri kromatofokusiranju se vzorec nanese na kolono z mešanjem z začetnim pufrom. Proteini, ki imajo pH nad svojo izoelektrično točko, so negativno nabiti in ostanejo blizu vrha kolone, medtem ko drugi proteini, ki imajo pH pod njihovo izoelektrično točko, migrirajo po koloni navzdol. Protein z najvišjo izoelektrično točko se eluira prvi, medtem ko se protein z najnižjo izoelektrično točko eluira zadnji iz kolone. Na to tehniko vpliva več dejavnikov, kot sta obarjanje beljakovin in linearnost gradienta pH.
Kaj je izoelektrično ostrenje?
Izoelektrično fokusiranje je tehnika, ki loči različne molekule na podlagi njihove izoelektrične točke. Znano je tudi kot elektrofokusiranje. Ta tehnika se pogosto uporablja za ločevanje beljakovin v gelu. Pri izoelektričnem fokusiranju se vzorec doda v imobilizirane gele z gradientom pH (IPG). IPG gel je matrica akrilamidnega gela, kopolimerizirana z gradientom pH. Proteini migrirajo proti katodi, dokler ne najdejo območja pH svojih izoelektričnih točk. Ko protein doseže pH, ki nima neto naboja, se migracija ustavi in nastane stacionarni pas. Podobno daje vsak protein pas na točki gradienta pH, ki ustreza njegovi izoelektrični točki.
Slika 01: Izoelektrično ostrenje
Izoelektrično fokusiranje je prvi korak dvodimenzionalne gelske elektroforeze. Pri tej tehniki se proteini najprej ločijo glede na njihove izoelektrične točke z izoelektričnim fokusiranjem in nato ločijo glede na njihovo molekulsko maso s pomočjo SDS-PAGE.
Kakšne so podobnosti med kromatofokusiranjem in izoelektričnim ostrenjem?
- Kromatofokusiranje in izoelektrično fokusiranje sta dve metodi visoke ločljivosti.
- Oboje temelji na izoelektrični točki proteinov.
- Te tehnike uporabljajo gradient pH.
- Oba postopka sta informativna za karakterizacijo variant človeškega hemoglobina.
- Lahko ločijo molekule, kjer se vrednosti pI razlikujejo le za 0,02 pH enote.
Kakšna je razlika med kromatofokusiranjem in izoelektričnim ostrenjem?
Kromatofokusiranje je tehnika kolonske kromatografije visoke ločljivosti, ki ločuje proteine glede na njihovo izoelektrično točko. Nasprotno pa je izoelektrično fokusiranje elektroforetska tehnika, ki loči proteine glede na njihovo izoelektrično točko z uporabo električnega polja vzdolž gradienta pH, ki nastane v kapilari. To je torej ključna razlika med kromatofokusiranjem in izoelektričnim ostrenjem.
Druga razlika med kromatofokusiranjem in izoelektričnim ostrenjem je ta, da kromatofokusiranje ne vključuje električnega polja, medtem ko izoelektrično ostrenje potrebuje električno polje.
Povzetek – Kromatofokusiranje proti izoelektričnemu ostrenju
Kromatofokusiranje in izoelektrično fokusiranje sta dve podobni tehniki, ki imata visoko ločljivost molekul, zlasti zelo podobnih molekul. Kromatofokusiranje je tehnika kolonske kromatografije visoke ločljivosti, medtem ko je izoelektrično fokusiranje metoda elektroforeze. Kromatofokusiranje ne vključuje električnega polja, za razliko od izoelektričnega fokusiranja. To torej povzema razliko med kromatofokusiranjem in izoelektričnim ostrenjem.
