Ključna razlika – PCR v primerjavi s sekvenciranjem DNA
PCR in sekvenciranje DNA sta dve pomembni tehniki v molekularni biologiji. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je postopek, pri katerem se ustvari veliko število kopij fragmenta DNK. Sekvenciranje DNK je tehnika, ki ima za posledico natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNK. To je ključna razlika med PCR in sekvenciranjem DNA. PCR je eden od glavnih korakov v sekvenciranju DNK.
Kaj je PCR?
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je tehnika pomnoževanja DNA, ki se uporablja v molekularni biologiji. Proizvaja na tisoče do milijone kopij določenega fragmenta DNK. To metodo je leta 1983 razvil Kary Mullis. Pri tej tehniki fragment DNA, ki ga je treba pomnožiti, služi kot matrica, encim DNA polimeraza pa doda komplementarne nukleotide k primerju, ki je na voljo v mešanici PCR. Na koncu reakcije PCR se sintetizira veliko kopij vzorčne DNK.
Obstajajo različne komponente mešanice PCR, vključno z DNK, DNK polimerazo (Taq polimerazo), primerji (naprej in nazaj), nukleotidi (gradniki DNK) in pufrom. PCR poteka znotraj stroja za PCR, v stroj je treba naložiti pravilno mešanico PCR in zagnati pravilen program. Ta tehnika omogoča izdelavo na tisoče do milijonov kopij določenega dela DNK iz zelo majhne količine DNK.
Reakcije PCR potekajo ciklično, da se proizvede vidna količina produktov PCR na gelu. Obstajajo trije glavni koraki, ki so vključeni v reakcijo PCR, in sicer denaturacija, žarjenje primerja in podaljšanje verige, kot je prikazano na sliki 01. Ti trije koraki potekajo pri treh različnih temperaturah. DNK obstaja v dvoverižni obliki z vodikovimi vezmi med komplementarnimi bazami. Pred implikacijo je treba dvoverižno DNK ločiti eno od druge. Izvaja se z visoko temperaturo. Pri visoki temperaturi se dvoverižna DNA denaturira v enojne verige. Nato bi se morali primerji približati bočnim koncem specifičnega fragmenta ali gena DNK. Primer je kratek del enoverižne DNK, ki je komplementaren ciljnemu zaporedju. Prednji in povratni primerji se žarijo s komplementarnimi bazami na stranskih koncih denaturirane vzorčne DNK pri temperaturi žarjenja. Primerji morajo biti toplotno odporni. Ko se primerji prižgejo z vzorčno DNK, encim taq polimeraza sproži sintezo novih verig z dodajanjem nukleotidov, ki so komplementarni ciljni DNK. Taq polimeraza je toplotno stabilen encim, izoliran iz termofilne bakterije, imenovane Thermus aquaticus. Pufer PCR vzdržuje optimalne pogoje za delovanje polimeraze taq. Te tri stopnje reakcij PCR se ponavljajo, da se proizvede potrebna količina produkta PCR. Po vsaki reakciji PCR se število kopij DNK podvoji. Zato je pri PCR mogoče opaziti eksponentno pomnoževanje. Produkte PCR je mogoče opazovati z gelsko elektroforezo in jih je mogoče očistiti za nadaljnje študije.
Slika 01: Glavni koraki reakcije PCR
PCR je dragoceno orodje v medicinskih in bioloških raziskavah. PCR ima posebno vrednost v forenzični znanosti, saj lahko pomnoži DNK za študije iz majhnih vzorcev kriminalcev in naredi forenzične profile DNK. PCR se široko uporablja na številnih področjih molekularne biologije, vključno z genotipizacijo, kloniranjem genov, odkrivanjem mutacij, sekvenciranjem DNK, mikromrežami DNK in testiranjem očetovstva itd.
Slika 02: Verižna reakcija s polimerazo
Kaj je sekvenciranje DNK?
Sekvenciranje DNK je določitev natančnega vrstnega reda nukleotidov – adenina, gvanina, citozina in timina v danem fragmentu DNK. Genetske informacije so shranjene v zaporedjih DNK z uporabo pravilnega vrstnega reda nukleotidov. Zato je iskanje natančnega vrstnega reda nukleotidov v fragmentu DNK zelo pomembno za poznavanje strukture in delovanja genov.
Protokol sekvenciranja DNK vključuje različne procese. Prvi korak je izolacija DNK ali genomske DNK organizma. Z uporabo PCR (kot je opisano zgoraj) je treba želeno regijo DNA pomnožiti. Pomnoženi produkt PCR je treba ločiti z gelsko elektroforezo in očistiti. Pomnoženi fragmenti služijo kot predloge za sekvenciranje. Sekvenciranje je mogoče izvesti po Sangerjevem sekvenciranju ali metodi visoko zmogljivega sekvenciranja. Sangerjevo sekvenciranje zahteva kapilarno elektroforezo nastalih fragmentov DNA. Določitev pravilnega vrstnega reda nukleotidov se lahko izvede z ročnim branjem avtoradiografov ali z uporabo avtomatiziranih DNA sekvencerjev.
Gensko sekvenciranje je prispevalo k projektu Človeški genom in olajšalo kartiranje človeškega genoma leta 2003. V forenziki je sekvenciranje DNK omogočilo identifikacijo posameznikov, ki kažejo edinstvena zaporedja DNK, in identificiralo kriminalce. V medicini se s sekvenciranjem DNK lahko odkrijejo geni, odgovorni za genetske in druge bolezni, poiščejo okvarjene gene in jih nadomestijo s pravilnimi geni. V kmetijstvu se informacije o zaporedju DNK nekaterih mikroorganizmov uporabljajo za proizvodnjo transgenih pridelkov z ekonomsko želenimi lastnostmi.
Slika 03: Sekvenciranje DNA
Kakšna je razlika med PCR in sekvenciranjem DNK?
PCR v primerjavi s sekvenciranjem DNA |
|
| Postopek PCR ustvari na tisoče do milijone kopij želenega fragmenta DNK. | Sekvenciranje DNK je postopek določanja natančnega vrstnega reda nukleotidov v danem fragmentu DNK. |
| Izid | |
| PCR ustvari na tisoče do milijonov kopij določenega fragmenta DNK | To povzroči pravilen vrstni red baz v določenem fragmentu DNK. |
| Vključenost ddNTP-jev | |
| PCR ne zahteva ddNTP. Uporablja dNTP. | Sekvenciranje DNK zahteva ddNTP za prekinitev nastajanja verige. |
Povzetek – PCR v primerjavi s sekvenciranjem DNA
PCR in sekvenciranje DNK sta zelo pomembni orodji na številnih področjih molekularne biologije. Pomnoževanje fragmentov DNA poteka s tehniko PCR, medtem ko se pravilen vrstni red nukleotidov fragmenta DNA določi s sekvenciranjem DNA. To je razlika med PCR in sekvenciranjem DNK.
